A disszeminált kandidózis nem invazív képalkotása a zebrafish Larvae Protocol-ban (lefordítva

Összegzés

A kis méret gyors fejlődése és a zebrafish átláthatósága nagy előnyöket jelent az 1-4. Fertőzés veleszületett immunszabályozásának vizsgálatában. Itt bemutatunk technikákat a zebrafish lárvák fertőzésére a patogén Candida albicans gombával. Mikroinjektálás útján a közelmúltban alkalmazott módszertan a NADPH-oxidáz fagociták aktivitásának a gombás dimorfizmus szabályozásában való részvételére vonatkozik 5 .

Absztrakt

A Candida albicans kórokozó által okozott disszeminált candidiasis klinikailag fontos probléma a kórházi betegeknél, és 30–40% -os mortalitásnak tulajdonítható. 6. A szisztémás kandidózist általában a veleszületett immunitás és a veleszületett immunsejt-összetevők genetikai hibáival rendelkező emberek irányítják. mint például a fagocita NADPH-oxidáz hajlamosabb a candidemia 7-9-re. A C. albicans és az immunsejtek közötti kölcsönhatás dinamikájáról in vivo nagyon keveset tudunk. Kiterjedt in vitro vizsgálatok kimutatták, hogy a gazdaszervezeten kívül a C. albicans a makrofágokon belül csírázik, és a 10–14-es neutrofilek gyorsan elpusztítják. Az in vitro vizsgálatok, bár hasznosak, nem tudják összefoglalni a komplexet lakókörnyezetben, amely magában foglalja a citokinszintek időfüggő dinamikáját, az extracelluláris mátrix kötődéseit és az intercelluláris érintkezéseket 10, 15-18. Ezeknek a tényezőknek a gazda-patogén kölcsönhatásban való részvételének vizsgálatához elengedhetetlen egy olyan modellszervezet megtalálása, amely intakt élő gazdaszervezetben nem invazív módon jeleníti meg a fertőzés ezen aspektusait.

A zebrafish lárvák egyedülálló és sokoldalú gerinces gazdaszervezetet kínálnak a fertőzés vizsgálatához. A fejlődés első 30 napjában a zebrafish lárváknak csak veleszületett immunvédelme van 2, 19-21, ami leegyszerűsíti a veleszületett immunitástól nagymértékben függő betegségek, például a disszeminált candidiasis tanulmányozását. A zebrafish lárvák kis mérete és átláthatósága lehetővé teszi a fertőzés dinamikájának leképezését sejtszinten, mind a gazda, mind a kórokozó szempontjából. Transzgénikus lárvák fluoreszcens immunsejtjei felhasználhatók a 22-24-es fertőzésben részt vevő specifikus sejttípusok azonosítására. A módosított antiszensz oligonukleotidok (Morpholinos) felhasználhatók különféle immunkomponensek, például fagocita NADPH-oxidáz leütésére és a gombás fertőzésre adott válaszváltozások tanulmányozására. A kis alsó gerinces alkalmazásának gyakorlati és etikai előnyei mellett a Zebra hal lárvák egyedülálló lehetőség a kórokozó és a gazdaszervezet közötti küzdelem intravitalis és színes ábrázolására.

A zebrafish-t számos emberi patogén baktérium fertőzésének modellezésére használták, és fontos szerepet játszott a mikobakteriális fertőzés megértésének fontos előrehaladásában 3, 25. A lárvák megfertőzésére azonban nemrégiben sokkal nagyobb kórokozókat, például gombákat használtak 5, 23, 26, és a mai napig nem volt részletes vizuális leírás a fertőzés módszertanáról. Itt bemutatjuk a zebrafish Prim 25 kamra hátsó agy mikroinjekciós technikáit, beleértve a korábbi protokollok módosítását. Eredményeink a gombás fertőzés zebrafish lárva modelljével különböznek az in vitro vizsgálatoktól, és megerősítik annak szükségességét, hogy az egyszerűsített Petri-csőrendszer helyett a komplex gépi környezetben vizsgáljuk meg a gazda-patogén kölcsönhatást 5.

Jegyzőkönyv

Az összes zebrafish-gondozási protokollt és kísérletet az Intézményi Állattartás és Foglalkoztatás (IACUC) A2009-11-01 protokollja alapján hajtották végre.

1. Morpholino és injekciós lárvaedények

Kísérlet időtartama: * (10-15 perc)

Nehézségi fok: *

  1. Tojásinjekciókhoz készítsen 2% -os agarózoldatot steril vízben és mikrohullámú sütőben. Amikor az oldat kihűlt, öntsön belőle egy extra mély Petri-csészébe (Fisher Scientific), amíg az félig meg nem telik. Hűtsük le jégben, és tegyük a tányért szintre.
  2. Miután a lemez kihűlt, a felső 15 ml 2% -os agarózréteget öntjük. Spray egy bordázott műanyag tojásinjekciós formát (Adaptive Tools of Science) steril vízzel egy spray palackból. Óvatosan helyezze a nyílást lefelé a forró agaróz formába. Amikor az agaróz kihűlt, használjon egy lapos fém spatulát (VWR Scientific), hogy elkülönítse a sablont az emelt AGA-tól. Fokozatosan távolítsa el a rácsot az agarózról. Csomagolja be az embrióinjekciós edényeket Parafilm-be (VWR Scientific), és fordítva tárolja 4 ° C-on.
  3. Hallárva injekciókhoz készítsen egy 2% -os agarózoldatot a leírás szerint. Öntsük az oldatot egy standard méretű Petri-csészébe (VWR Scientific), és tegyük félre szilárd állapotig. Tekerje be a Parafilm injekciós lárvák és a sátor lemezeit 4 ° C-on megfordítva.

2. Gombakultúra elkészítése

A kísérlet időtartama: ** (30 perc)

Nehézségi fok: **

3. Zebrafish fertőzések

Kísérlet időtartama: **** (1-3 óra)

Nehézségi fok: ****

4. A hal előkészítése a képen

A kísérlet időtartama: ** (30 perc)

Nehézségi fok: **

  1. Készítsük el a tricaine-metán-szulfonát-oldatot az előzőek szerint (200 mg/ml). Távolítsa el a fertőzött halakat, és vigye át tricaine-ba.
  2. Készítsen 47,9 ml 0,4% alacsony olvadáspontú agarózt (VWR Scientific) a tojásban és a vízben. Melegítsük fel az oldatot a mikrohullámú sütőben. Hűtsük 37 ° C-ra, és adjunk hozzá tricaine-metán-szulfonátot (200 mg/ml) a keverékhez
  3. Miután a halakat tricaine-metán-szulfonátban rögzítették, pipettázzon egyes halakat egy 0,4% alacsony olvadáspontú agarózt tartalmazó Petri-csészébe (VWR Scientific) (VWR Scientific).
  4. Ezután helyezze át az alacsony olvadáspontú agarózhalakat egy üvegfenekű lemez (MatTek Corporation) egyes lyukaiba képalkotás céljából. Használjon a lehető legkevesebb olvadáspontú agarózt, hogy a halak laposan feküdjenek a kapszula alján. Csak annyi tricaine-agarózt használjon, hogy kitöltse az üveg alsó lemezén lévő enner köröket.