Egy multidomén emberi simított receptor kristályszerkezete szuper ligandummal komplexben

emberi

  • Tárgyak
  • Összegzés
  • Bevezetés
  • Eredmények
  • Új ligandum racionális megtervezése a szerkezeti vizsgálatokhoz.
  • A többdimenziós emberi SMO általános felépítése
  • Egyedülálló multi-domain interakció
  • Az emberi SMO összehasonlítása más frizz osztályú receptorokkal
  • Vita
  • Mód
  • A TC114 szintézise
  • Strukturális vizsgálatokhoz tervezett SMO-FLA fúziós konstrukció
  • Az SMO-FLA fúziós fehérje expressziója és tisztítása
  • Kristályosítás LCP-ben a Synchrotron adatgyűjtéshez
  • A szinkrotron adatgyűjtése és a struktúra meghatározása
  • Kristályosítás LCP-ben az XFEL adatgyűjtéshez
  • XFEL adatgyűjtés és struktúra meghatározása
  • Hidrogén-deutériumcsere tömegspektrometriás elemzés
  • MD szimuláció
  • Fehérje előkészítés és rendszer felépítése.
  • Molekuláris dinamikus szimuláció és adatelemzés.
  • Sün jelző teszt
  • Western Blot elemzés
  • Az adatok elérhetősége
  • Kiegészítő információk
  • PDF fájlok
  • Kiegészítő információk
  • Peer review fájl
  • Hozzászólások

Tárgyak

  • Fejlődésbiológia
  • Nanokristallográfia

Összegzés

A kisimított receptor (SMO) a G-fehérjéhez kapcsolt receptor (GPCR) szupercsalád Frizzled osztályába tartozik, és a Hedgehog jelátviteli út kulcsfontosságú alkotóeleme. Itt bemutatjuk a multidomain humán SMO kristályszerkezetét, amelyet egy tervezett TC114 szerszámligandum köt meg és stabilizál, 2,9 Å szabad elektronröntgen lézerforrás felhasználásával. A szerkezet három különböző domén pontos elrendezését tárja fel: egy hét transzmembrán hélix domént (TMD), egy csukló domént (HD) és egy intakt extracelluláris ciszteinben gazdag domént (CRD). Ez az architektúra lehetővé teszi az alloszterikus interakciókat a ligandumok felismerése és a receptor aktiválása szempontjából fontos domének között. A strukturális adatok, a molekuladinamikai szimuláció és a hidrogén-deutériumcsere-elemzés kombinálásával megmutatjuk, hogy a transzmembrán helix VI, az extracelluláris 3 hurok és a HD központi szerepet játszik a jelátvitelben egy trigger mechanizmus segítségével. GPCR-ek.

Bevezetés

Eredmények

Új ligandum racionális megtervezése a szerkezeti vizsgálatokhoz.

A CRD csonka SMD-jét (ΔCRD-SMO) korábban több kismolekulával együtt kristályosították, beleértve az antagonistákat és a 3, 8, 9 agonistákat. Ezek a ligandumok és mások nem termeltek intakt CRD-t tartalmazó multi-domén SMO kristályait stabilizáló mutációk nélkül. A ΔCRD-SMO 3, 8, 9 korábbi struktúráinak elemzése azt sugallja, hogy egy több tartományból álló SMO kristályosodásához szükség lehet a szerkezet néhány speciális rugalmas részének stabilizálására. Például azt tapasztaltuk, hogy a 2. extracelluláris hurokban a β-hajtű tetején elhelyezkedő K395 részt vehet a szomszédos maradékokkal vagy 3. ligandumokkal való kölcsönhatásban, és ezért valószínűleg dinamikus konformációs állapotot vesz fel (1a. Ábra). Ezért feltételezzük, hogy e régió további stabilizálása egy meghatározott és erősebb interakció létrehozásával csökkentheti a konformációs heterogenitást.

( nak nek ) Az LY2940680 kötőrekesz közeli képe a ΔCRD - SMO szerkezetben (PBD ID: 4JKV). ( ) Az LY2940680 analógok megtervezése és evolúciója az aromás gyűrű szubsztituenseinek variációjával történő kristályosodás tanulmányozásához. ( c ) Az LY2940680 és analógjai reprezentatív Tm értékei a CPM hőcserélési teszt szerint. ( d ) Közeli nézet a TC114 kötő zsebében. A ligandum megkötésében szerepet játszó TC114 (narancssárga szénatomok) és SMO maradékok (cián szénatomok) oszlopképben vannak ábrázolva. A vevő világoskék rajzfilm ábrán látható. A többi elem a következõ színû: oxigén, piros; nitrogén, sötétkék; kén, sárga. A hidrogénkötések szaggatott bíborvonalként jelennek meg.

Teljes méretű kép

A multi-domain SMO struktúráink elemzése azt mutatta, hogy a TC114 ligandumba bevezetett nitrocsoport erősen kölcsönhatásba lép a K395-tel az SMO-ban, ahogy tervezték, és javítja a benzoilcsoport és az F484 közötti π - π halmozódást a helix VI-ban (1d. Ábra). Ezért arra a következtetésre jutunk, hogy a TC114 stabilizálja a multidomain SMO-t azáltal, hogy a VI spirált stabil konformációban tartja, ami viszont fokozza a kiterjesztett ECL3 és a hidrofób CRD horony közötti hidrofób kölcsönhatást. Ezért a tervezett TC114 ligandum elérte a kívánt célt, szuperstabilizáló szerként működött a hőstabilitási tesztben, és lehetővé tette a többdimenziós SMO kokristályosítás tanulmányozását.

A multidomain emberi SMO általános felépítése

Az SMO általános szerkezete (2a. Ábra; Kiegészítő 4. ábra) egy GPCR 7TM kanonikus hajtogatást oszt meg egy amfipatikus VIII-as spirállal, amely párhuzamosan fut a membrán síkjával. A CRD egyenesen ül a TMD tetején, és egyik oldalán a 3 extracelluláris hurok (ECL3), a másikon pedig egy összekötő hurok (181–190 maradvány) támasztja alá. A CRD-t és a TMD-t a HD köti össze (191–220. Maradvány). Továbbá a szerkezet extracelluláris oldalán (2b. Ábra) a VI spirál négy α-spirális fordulaton túlnyúlik a membrán felületén, a VI spirál teteje pedig egy nem prolin fordulattal a CRD felé fordul, kinyúlva a hidrofób barázdája és kulcscsatlakozás összekapcsolása a CRD és a TMD között. A CRD (V107, L108, L112 maradékok), HD (V210 maradék) és ECL3 (V494, I496 maradványok) hidrofób zsebet képez (2c. Ábra). Korábban arról számoltak be, hogy ez a zseb egy 7, 19 oxiszterol-kötő helyet alkot .

( nak nek ) Az emberi SMO globális szerkezete a TC114 komplexben, XFEL-ben meghatározva. A TC114 narancssárga pálcikaként jelenik meg. A CRD, a Linker, a HD és a TMD rajzfilm narancssárga, sötétkék, ciánzöld és világoskék színnel van jelölve. A membrán határát narancssárga pontozott vonallal jelöltük. Az N-kapcsolt glikánok (NAG) zöld sávokban vannak feltüntetve. ( ) Az SMO felülnézete az extracelluláris oldalról. Hidrofób zsebet alkot a hidrofób CRD horony és az ECL3 (tengeri fogantyú). ( c ) A CRD és az ECL3 kulcsfontosságú maradványai, amelyek meghatározzák a hidrofób zsebet, cián, illetve világoskék sávokban vannak feltüntetve.

Teljes méretű kép

Egyedülálló multi-domain interakció

Teljes méretű kép

Az emberi SMO összehasonlítása más frizz osztályú receptorokkal

( nak nek ) A CRF hFzd-4 (PDB ID: 5CL1) és mFzd-8 (PDB ID: 4F0A) CRD SMO (hSMO) egymásra helyezett struktúráinak oldalnézete. Az SMO, a hFzd-4 és az mFzd-8 rajzfilmekként világoskék, mészzöld és narancssárga színben vannak feltüntetve. A Wnt és a Norrin sötétszürke, illetve narancssárga rajzfilmekként vannak feltüntetve. Az mFzd-8 CRD palmitoilcsoportja tengeri szférákban látható. ( ) 1. hely: A palmitoil-csoport közeli képe egymással kölcsönhatásban lévő maradékokkal, például narancssárga rudakkal. A palmitoil-csoport tengeri botokban látható. A hidrofób zsebet alkotó SMO-maradványok világoskék, az mFzd-8 narancssárga oszlopokban vannak feltüntetve. ( c ) 2. hely: Az SMO és a hFzd-4 CRD felülete. Norrin világos narancssárga rajzfilmben látható. A színváltozás a világosvöröstől a sötétvörösig a felület tulajdonságának változásának felel meg hidrofilről hidrofóbra. A horrzs kötőhelyét a hFzd-4 CRD felületén fekete pontozott kör jelöli, a megfelelő helyet szintén jelölve az SMO felületén.