Nem kanonikus aminosav genetikai kódolása antitest-gyógyszer konjugátumok előállításához
Összegzés
Antitest, lizin eredetű ciklopropén beépítése lehetővé teszi a tetrazint tartalmazó molekulák specifikus, gyors és hatékony megkötését konjugált antitest gyógyszerek előállításához.
Absztrakt
Bevezetés
Az antitest-gyógyszer konjugátumok (ADC) kombinálják a bioterápiás szerek szelektivitását és a kis citotoxikus molekulák hatékonyságát. A legtöbb ADC azt állítja, hogy csökkenti a hagyományos kemoterápia mellékhatásait olyan gyógyszerek célzásával, amelyek befolyásolják a rákos sejtekben a DNS vagy mikrotubulusok polimerizációját 1. Az Food and Drug Administration (FDA) által jóváhagyott első generációs ADC-k a lizinek és a ciszteinek módosításán alapulnak, amely módosított molekulák keverékeit állítja elő különböző pozíciókban, csökkent farmakokinetikai tulajdonságokkal 2. Éppen ellenkezőleg, a gyógyszerek antitestekkel történő specifikus konjugálása jobb, 3, 4 terápiás indexű vegyületeket eredményezhet. A homogén ADC-k előállításának kihívásával próbálkozva számos szelektív kémiai és enzimatikus módosítást jelentettek 1, 5. A jelenlegi módszerek azonban csak egy bizonyos pozíciót célozhatnak meg az antitesten, alacsony fehérje-expresszióval küzdenek, alacsony stabilitású kapcsolókat biztosíthatnak, vagy lassú reakciókra és alacsony hozamra támaszkodhatnak.
A nem kanonikus aminosavak (ncAA) beépítése a genetikai kód kiterjesztésével lehetővé teszi a reaktív bioortogonális csoportok rengeteg helyspecifikus telepítését a fehérjékben, potenciálisan túllépve az ADC-k előállításához használt egyéb módszerek korlátait. A cél (stop) kodonra adott válaszként az ncAA-k kódolása aminoacil-tRNS-szintetáz/tRNS-párokon alapul, amelyek ortogonálisak az endogén párokra, amelyek 6 kánonikus aminosavat tartalmaznak. Számos NcAA-t beépítettek az antitestekbe az ADC-k előállításához. A terápiás gyógyszerek konjugálásával kapcsolatos alkalmazások esetében azonban különféle felelősségek szenvednek jobban. A p-acetil-fenilalanin (pAcF) 7, 8 nem teljesen bioortogonális, alacsony pH-értéket (4,5) és hosszú reakcióidőt (> 60 óra) igényel, míg az azidok, például p-azidofenilalanin (pAzF) 7, 9, 10, p- azidometil-fenil-alanin (megfordítás) 11 és a lizin-azid (AzK) 12, 13 származékai redukálódhatnak a 14. sejtben, a Huisgen aktivitásának katalizálására használt réz pedig oxidatív károsodást idézhet elő 15 .
Noha transzport alapú alternatív ncAAs-ciklo-oktént (TCO), ciklooktint (SCO) és biciklo [6.1.0] nonént (BCN) nemrégiben egy antitestben kódoltak bioképalkotás céljából, az expressziós rendszer nagyon alacsony hozammal jár (0,5 mg/l) 16. Másrészt a ciklooktenek és a ciklooktinek nagy és hidrofób fogantyúk, amelyek növelhetik az ADC hajlamát a hasznos teherekre - az aggregációs ADC-k hagyományosan hidrofóbak, a kolbászgép fizikai-kémiai tulajdonságai pedig magas farmakokinetikai és terápiás hatásindexet mutatnak Ezzel szemben az 1,3-diszubsztituált ciklopropének kicsi reaktív csoportok, amelyek minimális változásokat okozhatnak a fehérje szerkezetében és a fizikai-kémiai tulajdonságokban 18. A ciklopropének szelektíven és gyorsan reagálnak a tetrazinokkal egy inverz elektronikus igényű Diels-Alder ciklusterdíción keresztül 19. Ebben a protokollban lizintartalmú származékot használunk (CypK, 1b. Ábra)) egy metil-ciklopropén, amelyet a szterikus akadályok kevésbé érintenek, mint a nagyobb szűrt telítetlen gyűrűk, és reakciósebessége 1-30 M -1 s -1 nagyságrendű vizes közegben 18, 20 .
Nemrégiben arról tájékoztatott minket, hogyan lehet beépíteni a CypK-t az antitestekbe az ADC-k előállításához, ha ezt a bioortogonális minimális tengelyt tetrazintartalmú molekulákkal reagáltatjuk 21. Itt részletesebben leírjuk az ADC előkészítési eljárását, külön hangsúlyt fektetve a nehezebb lépésekre. A CypK beépülését egy pirrolizil-tRNS-szintetáz (PylRS)/tRNACUA (PylT) párral célozzuk meg az antitest nehézláncába (HC) 22 bejuttatott borostyánsárga kodonra válaszul. Itt két plazmidot használunk a tranziens transzfekcióhoz (1a. Ábra)), amely az antitest nehéz láncát kódolja, a másik pedig a könnyű láncot (LC) kódolja, mindkettő tartalmazza a PylRS/PylT kazettát. Alternatív megoldásként egy stabil sejtvonal, amely nagyobb antitesthozamokat tesz lehetővé, fáradságosabb eljárással állítható elő. .
A fenti expressziós rendszerek képesek a vad típusú antitestekhez hasonló szinten CypK-val terápiás anti-HER2 immunglobulin 1 (IgG1) trasztuzumabot előállítani. Kiválasztottuk a nehéz lánc CH1 doménjének első helyzetét az ncAA kódolására (HC-118TAG). Ez az ADC-k 23 leggyakrabban módosított helye, és HC-118 (EU felsorolás) néven ismert, de HC-121 (szekvencia helyzet) és HC-114 (Kabat felsorolás) 24 néven is ismert. Mivel ez a helyzet az IgG1-ekben megőrződött, ezeknek az expressziós rendszereknek érzékenyeknek kell lenniük a legterápiásabb antitestekre.
Bemutatjuk, hogy a trasztuzumab (CypK) 2 könnyen tisztítható az A fehérjéből, majd hidrofób interakciós oszloppal (HIC-FPLC) gyors fehérjetartalmú folyadékkromatográfia következik. Ezt követően az antitest 3 órán belül kovalens a mikrotubulus polimerizációs inhibitor monometil auristatin E (MMAE) iránt, amelyet az FDA által jóváhagyott Adcetris ADC-ben használnak. Itt benzilszármazék-tetrazin MMAE-t (tetrazin-vcMMAE) használunk egy linkerrel, amely egy glutarát távtartót és egy valin-citrullin proteáz labilis komponenst tartalmaz, amelyet egy önimmunatív p-amino-benzil-alkohol-egység követ; Ezt a linkert a katepszin B hasítja a lizoszómában az ADC internalizálásakor, ami a 25 toxin felszabadulását eredményezi nyom nélkül. A reakció szélességének igazolására, hogy az antitest a fluorofór-tetrametil-rodaminhoz (TAMRA) is kötődik. Megmagyarázzuk, hogyan lehet ellenőrizni a konjugátum azonosságát folyadékkromatográfiával, tömegspektrometriával (LC-MS) összekapcsolva, és kiszámítani a gyógyszer-antitest arányt (DAR) nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával hidrofób kölcsönhatás oszlopon (HIC-HPLC). .