5 trükk ahhoz, hogy szakértő legyél a Western Blot laboratóriumokban
Molekuláris biológia, fehérjék
Öt gyakorlati tipp a Western Blot-szakértővé váláshoz
A Western blot (WB) továbbra is a legszélesebb körben alkalmazott módszer a fehérjék szétválasztására és kimutatására, és ennek ellenére még mindig unalmas, hogy finomítani kell az egyes kísérleteket. Kísérletünk optimalizálása kulcsfontosságú, és az olyan tényezők, mint: az antitest minősége, a blokkoló pufferek vagy az átvitel hatékonysága kulcsfontosságú lépés a siker érdekében.
Részletesen elemezzük, hogy milyen tippek és eszközök segítségével javíthatunk eredményeinken.
1. Töltse be a megfelelő mennyiségű fehérjét
Az egyes üregekbe töltendő fehérje mennyisége változó és a kutatónak optimalizálnia kell, mivel ez egy tényező, amely függ a kifejezési szintek annak a génnek a szövetében. Ezenkívül figyelembe kell venni, hogy mely minta térfogata beismeri az a csésze. Között azonban 10. Y 50 ug fehérje szövethomogenátumból és között 10. Y 100 ng a tisztított minták összes fehérje általában elegendő.
2. Szükséges-e a mintáim csökkentése vagy denaturálása?
Az antitest műszaki adatlapjának áttekintése elengedhetetlen ahhoz, hogy tudjuk, hogyan kell elkészíteni a mintáinkat. Jellemzően a WB mintái fehérjék denaturált. A natív fehérjék harmadlagos szerkezettel rendelkeznek, és konformációjuk alapvető szerepet tölt be a fehérjékben funkció fehérje. Ez a szerkezet azonban hatással lesz a migráció ezeknek a fehérjéknek a pórusok poliakrilamid. A fehérje denaturációja a következő módon végezhető el:
- Nátrium-dodecil-szulfát (SDS) egy detergens, amelyet a hidrogénkötések lebontására és a harmadlagos szerkezet szétbontására használnak.
- Redukálószerek, mint pl b-merkaptoetanol vagy ditiotreitol (DTT) a ciszteinek közötti diszulfidhidak csökkentésére.
- Hő a mintákat 100 ° C az SDS denaturálásához és megkönnyítéséhez.