A caveolin interakció szabályai kv1

Tárgyak

Összegzés

Bevezetés

Itt tanulmányozzuk a Cav hatását a Kv1-csatornák lipid-tutajának orientációjára egy lehetséges konzervált CBD-motívum funkciójának elemzésével a Shaker családban. A Kv1.3 és a Kv1.5 egyaránt megcélozza a lipid tutajokat, de csak a Kv1.3 hatékonyan lépett kölcsönhatásba Cavval a CBD-n keresztül, ahol ez az asszociáció elengedhetetlen a csatornák lokalizálásához ezeken a területeken. Ezenkívül a Kv1.3 viselkedését és aktivitását a Cav1 jelenléte szabta meg. Ezért a CBD jelenléte a Kv1.3 T1 közelében fontos funkcionális következményekkel jár a Kv1.3 csatorna fiziológiájára nézve.

Eredmények

A lipid tutajok Kv1.3 és Kv1.5 partíciójának differenciális caveolin-függése

caveolin

A jelzett csatornával (YFP-jelölt) történő transzfekció után 24 órával nyert HEK Cav1 teljes fehérje-lizátumokat immunprecipitáltuk kaveolin ellen. Az SDS-PAGE-vel elválasztott és a GFP (csatorna) és a caveolin antitestek ellen immunblotolt (IB) minták. ( NAK NEK ) A csonka Kv1.3 csatornák és a Kv1.3-Kv1.5 kimérák sematikus ábrái. Kv1.3 domének: fehér hordók és fekete vonalak. Kv1.5 domének: szürke hordók és szürke vonalak. ( ) Kiindulási anyagok. A felső panelen a szűrőket immunblotoltuk a GFP (csatornák) ellen. Az alsó panelen a szűrőket Cav-tal tesztelték, hogy kimutassák a Cav-immuncsapódást. ( C ) Immunprecipitátok. Ellenanyag (IP-) hiányában nem tapasztaltunk immuncsapadékot.

Teljes méretű kép

A Caveolin 1 kölcsönhatásba lép a Kv1.3-tal a csatorna N terminálján elhelyezkedő CBD aláíráson keresztül

A HEK Cav- (bal oldali panelek) és a HEK Cav1 (jobb oldali panelek) Kv1.3CBD ( NAK NEK ) és mutáns Kv1.5CBD csatornák ( ) (166 FQRQVWLLF 174 - AQRQVGLLA és 232 FQRQVWLIF 240 - AQRQVWLIF 240 - AQRQVWLIF 240). ( C ) A Kv1.3 vagy Kv1.3CBD-t expresszáló HEK Cav1-et caveolin (IP: Cav1) ellen immunprecipitáltuk caveolin antitest jelenlétében (+) és távollétében (-). A mintákat SDS-PAGE-vel elválasztottuk és Kv1.3 (IB: Kv1.3) és caveolin (IB: Caveolin) SM: kiindulási anyag ellen immunfoltot készítettünk; SN: felülúszó; PI: immunprecipitátum.

Teljes méretű kép

Nem találtunk kölcsönhatást a Kv1.5 és a Cav1 között; amikor azonban a feltételezett Kv1.5 CBD-t Kv1.3-ra (Kv1.5I239L) konvertáltuk, pozitív Cav1 koimmunoprecipitációt figyeltünk meg S4. Ezenkívül a bizonyítékok arra utalnak, hogy a Kv1.5 szupramolekuláris komplexek, köztük az SAP97 33, 34 közvetett kölcsönhatásba léphet a caveolinokkal. Az SAP97 (szinapszis-asszociált fehérje 97) a membránhoz kapcsolódó guanilát-kináz (MAGUK) család tagja, amely magában foglalja a PSD95-et is (Postsynaptic density protein 95). Ezért a Kv1.5-et expresszáljuk PSD95 jelenlétében és hiányában a HEK Cav1 sejtekben. Ebben a forgatókönyvben a Kv1.5 együtt immunimmunizálódott a Cav1-gyel, csak PSD95 jelenlétében (S4. Ábra). Ezért adataink azt sugallják, hogy míg a Kv1.3 CBD teljes integritása elegendő a Cav1-nel való kölcsönhatáshoz, a Kv1.5-hez szükség van segítő fehérjékre.

Vita

A bizonyítékok azt mutatják, hogy a Kv1.3 megcélozza a specifikus 35, 36 membránhelyzeteket és a helyváltozásoknak kóros következményei vannak 37. Vizsgálatunk kiemeli a Kv1.3 csatorna membránfelületének megoszlásának fő mechanizmusát. Itt számolunk be arról, hogy a Kv1 (Shaker) csatornák közül csak a Kv1.3 és a Kv1.5 szignifikánsan célozta meg a lipid tutajokat. Bár a Kv1.5 felhajtóereje független volt a caveolin expressziójától, a Kv1.3 lipid tutajok koncentrációja kaveolin dózisfüggő módon nőtt. Ennek fiziológiai jelentősége van, mert Cav1 -/- egerekből származó BMDM-ben igazolták. Ezenkívül a caveolin csatorna kolokalizációja magasabb volt Kv1.3-mal, mint Kv1.5-vel. Végül egyértelműen meghatároztuk azt a CBD-t, amely a Kv1.3 N-terminális doménjében található, és amely a Cav1 kölcsönhatásért és a csatorna lipid-tutajának helyéért felelős elem. Mivel a lipid tutajok orientációját javasolták ioncsatorna-szabályozás mechanizmusaként, eredményeink hozzájárulnak ehhez a terjeszkedő mezőhöz.

Összefoglalva, eredményeink segítenek tisztázni azokat a mechanizmusokat, amelyek a Kv1 csatornákat olyan speciális felületi mikrodoménekre irányítják, amelyek részt vesznek a sejtek válaszainak finomhangolásában. Más Kv1 idegsejtcsatornákkal ellentétben a Kv1.3 kölcsönhatásba lép a caveolinnal egy CBD-n keresztül, amely a csatorna N-terminális doménjében helyezkedik el, az első transzmembrán szegmens mellett, valamint a T1 domén és a Kvβ kötőhely közvetlen közelében. Ez az asszociáció a Kv1.3-at olyan csatorna struktúrákra irányítja, amelyek a csatorna membránjának dinamikáját és aktivitását egyaránt szabályozzák.

Mód

Expressziós plazmidok és helyspecifikus mutagenezis.

A patkány Kv1.3-at a pRcCMV-ben TC Holmes (Kaliforniai Egyetem, Irvine, Kalifornia) biztosította. A pGEM7 patkányban lévő Kv1.1 és Kv1.4, valamint a pBK konstrukciókban lévő humán Kv1.5 elemeket pEYFP-C1 és pECerulean-C1 (Clontech) szubklónoztuk. A Kv1.3/Kv1.5 kimérákat a pEYFP-rKv1.3 és a pEYFP-hKv1.5 csatornákban hoztuk létre úgy, hogy a BglII és EcoRI helyeket beépítettük a csatornák termináljának N és C tartományába. A mutánsokat a QuikChange helyhez irányított mutagenezis készletek (Stratagene) felhasználásával állítottuk elő. A LoopBAD szekvenciát (BAD, biotin akceptor domén) inszertáltuk a pEYFP-Kv1.3 első extracelluláris hurokjába az rKv1.3LoopBAD konstrukció egy már létező NruI helyén belül. A pBtac_BirA konstrukciót tartalmazó E. coli biotin ligázt alkalmaztuk az előzőekben leírtak szerint54. A pECerulean-C1 patkány Cav 1-et JR Martens (Floridai Egyetem Orvostudományi Kar) biztosította. A Cav1-et Cav-pECerulean (HindIII-BamHI) emésztésével inszertáltuk a pcDNS3-ba. A konstrukciókat szekvenálással igazoltuk.