A CRISPR útmutatók vírusszállítása az egér prosztata számára a génmódosító protokollhoz (lefordítva
Összegzés
Ez a protokoll új módszert ír le a vírus egér prosztatába juttatására. A CRISPR/Cas9 technológia, a gén túlexpresszió vagy a Cre rekombináz bejuttatása segítségével a technika lehetővé teszi a génexpresszió ortotopikus megváltoztatását, és új egérmodellt vezet be a prosztatarákra.
Absztrakt
A prosztatarák növekvő előfordulása mellett döntő jelentőségű az új daganat-hajtók vagy modulátorok azonosítása. A prosztatarák genetikailag módosított egérmodelljeit (GEMM) gátolja a tumor heterogenitása és a mikroevolúció komplex dinamikája. A prosztatarák hagyományos egérmodelljei közé tartoznak, de nem kizárólag, a csíra és a feltételes kiütések, az onkogének transzgenikus expressziója és a xenograft modellek. A de novo mutációk generálása ezekben a modellekben összetett, időigényes és költséges. Ezenkívül a legtöbb hagyományos modell a prosztata epithelium nagy részét célozza meg, míg az emberi prosztatarák köztudott, hogy izolált eseményként csak a sejtek kis csoportjában fejlődik ki. Az értékes modelleknek nemcsak a prosztatarák iniciációját kell szimulálniuk, hanem az előrehaladott betegséggé való progressziót is.
Itt leírunk egy módszert a prosztata hámjának egyes sejtjeinek megtámadására, a vírusrészecskék átalakító sejtjeire. Az egér prosztatájára irányuló vírus bejuttatása lehetővé teszi a gén expressziójának megváltoztatását a prosztata hámjában. A vírus mennyisége és típusa ezúton meghatározza a specifikus sejtek számát a genetikai változtatáshoz, néhány sejt transzdukciójával a rák megindításához és sok sejt génterápiához. A húgyúti traktus elülső, disztális lebenyébe történő műtéti alapú injekcióval ebben a modellben a daganat megnövelhető anélkül, hogy az állat vizeletfunkcióját rontaná. Továbbá, a prosztata hámsejtek csak egy részének megcélzásával a technika lehetővé teszi a daganat klónikus terjeszkedését, és így utánozza az emberi tumor iniciációját, progresszióját, valamint az alapmembránon keresztüli inváziót.
Ez az új technika egy erőteljes prosztatarák modellt kínál, nagyobb fiziológiai jelentőséggel. Az állatok szenvedése korlátozott, és mivel nincs szükség további tenyésztésre, az összes állatszám csökken. Ugyanakkor felgyorsult az új jelölt gének és útvonalak elemzése, ami viszont költséghatékonyabb.
Bevezetés
A prosztatarák kimutatása és kezelése jelentősen javult az elmúlt évtizedben. Ennek ellenére a prosztatarák előfordulása növekszik, a várható élettartam miatt. Becslések szerint világszerte 1,1 millió új esettel ez a férfiak egyik leggyakoribb oka a rákkal kapcsolatos halálozásnak 1. A prosztatarák lassan fejlődik, de amikor a rák előrehaladott metasztatikus állapotba fejlődött, a prognózis gyenge a korlátozott kezelési lehetőségek miatt. Eddig csak néhány gént azonosítottak ennek a ráknak a gyakori hajtóerejeként, és heterogenitásuk és multifokalitásuk kizárja a biomarkerek és a célozható betegség-hajtók detektálását 2, 3 .
A klasszikus GEMM-generációs technikák összetettségük, idő- és költségköltségeik miatt gyakran romlanak. Feltételes modelleket széles körben alkalmaztak a prosztatarák jelölt génjeinek tanulmányozásához, amelyek embrió mortalitást eredményeznek, amikor inaktiválják a 4 csíravonalban. Gyakoribb modellek egy specifikus prosztata Cre rekombinázt tartalmaznak, amelyet egy módosított Probasin 5 vagy PSA 6 promoter hajt, amelyet további keresztezéssel integrálnak a GEMM-be. Ezekben a modellekben az érdekes gén a legtöbb prosztata hámsejtben lesz megcélozva, ami az egész szervben hiperpláziát generál, ami károsíthatja az állat vizeletcsatorna működését .
A Cre fehérje vírusos bejuttatása az egér prosztata elülső lebenyébe történő injekcióval megoldhatja ezt a problémát, ha csak néhány sejtet céloz meg 8. Figyelembe véve, a módszer a laboratóriumok lehetséges műszaki követelményeinek, ismereteinek és célkitűzéseinek sokféle variációját élvezi. Többek között bemutatták az Adenovirus JunB és Pten 9 vagy Lentivirus Pten és Trp53 10 alkalmazásának sikeres megközelítését. A transzgének, például a luciferáz, a vírusszerkezet vagy a GEMM hozzáadása szintén lehetővé teszi a betegség progressziójának nem invazív nyomon követését biolumineszcens képalkotással 11 .
A CRISPR/Cas9 technológián alapuló genom-szerkesztés új és gyors lehetőséget tár fel a rák tanulmányozására a szomatikus kiütések gyors generálása révén 12. Az egér prosztata elülső lebenyébe irányított egyetlen vezető RNS-ek (sgRNS-ek) vírusos bejuttatása a prosztatarák relevánsabb fiziológiai modelljét hozza létre. Ily módon a kért mutációkkal rendelkező sejtek terjeszkedésre és invázióra képes klónokat képezhetnek. Ezen túlmenően, a különböző célgénekhez vezető RNS-ek felhasználásával különféle génekben megváltozott sejtklónokat hozhatunk létre. Ez lehetővé teszi a tumor heterogenitását és a rák előrehaladásának természetes szelekciós nyomását, ami feltárhatja a gének vagy az episztatikus mechanizmusok egyes változásainak fontosságát.