A makrofágok izolálása, jellemzése és tisztítása az érintett szövetekből
Összegzés
Ez a protokoll lehetővé teszi a kutató számára, hogy elkülönítse és jellemezze a különböző gyulladt fókaszövetek rezidens makrofágszövetét, amelyet az anyagcserezavarok étrend által kiváltott modelljeiből nyernek ki.
Absztrakt
Bevezetés
Egérmodelleket használtak az emberi betegségek dinamikájának tanulmányozására. A rezidens sejtek helyes elkülönítése a beteg állapotban lévő egerek szövetétől platformot adhat a betegség patogeneziséhez való molekuláris és sejtes hozzájárulás megértéséhez 1. Az egyik rendellenesség, amely létfontosságú, az elhízás. Az elhízás előfordulása világszerte folyamatosan növekszik, párhuzamosan az inzulinrezisztenciával és a 2-es típusú diabetes mellitusszal, a szív- és érrendszeri megbetegedésekkel és a zsírmáj betegségekkel 2, 3. A túlzott tápanyagfogyasztást inkább torzítja a fizikai aktivitás csökkenése, amely megváltoztatja a zsírszövet jeleit, ami megváltoztathatja más perifériás szövetek, például a máj és az aorta sejtkörnyezetét. A metabolikus homeosztázis ilyen megzavarása krónikus, alacsony fokú szisztémás gyulladást eredményez 5 .
A rezidens klasszikus aktivációja az aortára és a májra, valamint a makrofág fehér zsírszövetbe (WAT) történő felvétele kimutatták, hogy nemcsak a metabolikus jelek diszregulációját indítja el, hanem fenntartja a gyulladást is 6, 7. A makrofágok fenotípusos és funkcionális heterogenitása szorosan összefügg az elhízás patogenezisével, amely társbetegségekhez kapcsolódik. A makrofág polarizáció dinamikus plaszticitása lehetővé teszi, hogy ezek a sejtek különféle aktivált fenotípusokat mutassanak be, amelyek koordinálják a gyulladás progresszióját és feloldódását. Míg a klasszikusan aktivált makrofágok (M1) részt vesznek a gyulladás terjedésében, addig az aktivált makrofágok (M2) összefüggésbe hozhatók a felbontással és a szövetek helyreállításával .
Amint a test metabolikus stressznek van kitéve, a fehér zsírszövet rendellenesen felhalmozódik. A megnagyobbodott zsírszövet vonzza és visszatartja azokat a gyulladásos sejteket, amelyek mélyen megváltoztatják a normális zsírsejtek működését, elősegítve az inzulinrezisztenciát, a hiperglikémiát és a 2-es típusú cukorbetegséget, végül az inzulinrezisztenciát vagy a hiperglikémiát 11, 12. Ezzel párhuzamosan a fehér zsírszövet átalakítása a gyulladásos jelekre reagálva a zsírszövet (M1) klasszikus aktivált makrofágjainak (ATM) beszivárgásával (13, 14). Ez a többsejtű szerv olyan jelek kaszkádját fejti ki, amelyek kisiklják a test többi szervének, például az aortának és a májnak a normális működését 4 .
A máj egy metabolikus erőmű, amely a szorosan szabályozatlan WAT 15 ingereire reagálva alkalmazkodik. A máj-makrofágok vagy a Kupffer-sejtek az anyagcsere-változásokra válaszul gyulladásos citokineket választanak ki, amelyek mind a parenchymát, mind a nem parenchymás sejtfenotípust átalakítják, és elősegítik a szövetek átalakulását. A máj lipidjeinek felhalmozódása, gyulladás, túlzott extracelluláris mátrix lerakódások, nekrózis és esetleges funkcióvesztés követi a gyulladásos inzultusokat, amelyek hozzájárulnak az alkoholmentes zsírmájbetegséghez kapcsolódó májkárosodás széles skálájához 16 17, 18, 18 .
A károsodott WAT és májfunkcióval párhuzamosan a nagy artériák lipideket halmoznak fel az artéria falán, miközben a test krónikus metabolikus stressznek van kitéve 19. Az artériás lipidfelhalmozódás kiváltja az aktivált endothelsejtek kemokin-szekrécióját, és ezt követően monociták toborzását 20. A toborzás után a monociták szaporodnak, differenciálódnak, lenyelik a lipoproteineket és habsejtekké válnak. Az aterogenezist a szövetekben rezidens toborzott és lipidekkel terhelt makrofágok proinflammatorikus aktivitása indítja el és tartja fenn. Az ezen atherogén mikrokörnyezetben továbbított extracelluláris és intracelluláris stressz jeleknek engedve ezek a makrofágok részt vesznek egy apoptózis jelző kaszkádban. Amint ezek a habsejtek elpusztulnak, hozzájárulnak lipidtartalmukhoz, amely kitölti az elváltozás nekrotikus alapját, ami plakkrepedéshez, miokardiális infarktushoz és szélütéshez vezet.
Összességében a makrofág fenotípusok heterogenitása részben szervezi az elhízást, amelyet a normál szövetek, például a WAT, a máj és az aorta 8, 21 gyulladásos változásai okoznak. A toborzott és a rezidens makrofágok jellemzése betekintést nyújthat a potenciális molekuláris célpontokba, amelyek manipulálják az 1. makrofág fenotípust. Az elhízás által kiváltott gyulladt szövetekben a makrofágok hatékony jellemzéséhez egysejtű szuszpenzió nyerhető enzimatikus emésztéssel. Az ilyen disszociációs protokolloknak hatékonyaknak kell lenniük a kötőszövet kellő lebontásában, miközben minimalizálják az immunsejt pusztulását és optimális sejtteljesítményt nyújtanak. Az enzimkeverék függ a szövet típusától és annak szerkezeti felépítésétől. Az ellenálló szövetek, például az aorta a májhoz és a WAT-hoz képest magasabb enzimaktivitást igényelnek a szövetek disszociációjának eléréséhez. A sejtszuszpenzióból a rezidens makrofágok egyértelműen jellemezhetők vagy izolálhatók további downstream analízishez, például transzkripciós profilozáshoz.