A Mycobacterium avium paratuberculosis kimutatása félig száraz területen található kecskékben
A Mycobacterium avium paratuberculosis mezei törzsét Dr. Marco Antonio Santillán adományozta a CENID Microbiology INIFAP-tól, ezt a törzset használták pozitív kontrollként a PCR-vizsgálatban.
2008 végén 139 széklet- és vérmintát gyűjtöttek 1 és 3,5 év közötti kecskékből a La Mesilla közösségben, Tecozautla községben. Ez a település Hidalgo államban található, a szélesség 20 ° 48 ', a hosszúság -99 ° 67' párhuzamok között, 1890 méteres tengerszint feletti magasságban. Ezen a területen vannak olyan vidéki termelők, akik alacsony technikai színvonalú produkcióval rendelkeznek, kevés megelőző orvosi gyakorlattal, és a kecsketermelés kiterjedt. 8 különböző állománnyal dolgoztak, a Map minden gyanúsítottja. Az ürüléket zsákokba helyezték, a vérmintákat vákuumcsövekbe antikoaguláns nélkül. Összegyűjtés után a mintákat jéggel ellátott termoszba helyeztük megőrzésük és későbbi elemzésük céljából az Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco egység mezőgazdasági mikrobiológiai laboratóriumában.
Ziehl-Neelsen (ZN) folt
Az összes székletmintát egy speciális sav-alkohol-gyors festéssel (17) elemeztük, amely alapvetően sav-alkohol-rezisztens bacilusok jelenlétét tárja fel, kompatibilisek a Map.
DNS-extrahálás székletmintákból
Beágyazott PCR a térképészleléshez
Az első amplifikációhoz az IS 900-F (5 'TGATCTGGA CAATGACGGTTACGGA 3') és az IS 900-R (5 'CGCGGCACGGCTCTTGTT 3') primereket használtuk, amelyek 563 bp (18) szorzatot amplifikáltak. A PCR-reakció: 45 µl PCR-keveréket tartalmazott (22 mM Tris-HCl, pH 8,4, 1,65 mM MgCl 2, 220 uM dGTP, 220 dATP, 220 uM dCTP, 220 uM dTTP, 2 U Taq-polimeráz (Promega), 300 pM az első IS900-F, 300 pM az első IS900-R és 2 µl DNS-minta A PCR-ciklusok körülményei a következők voltak: kezdeti denaturáció 94 ° C-on 3 percig, majd 35 ciklus 94 ° C-on 1 percig, 56 ° C 1 percig és 72 ° C 1 percig A második amplifikációhoz (beágyazott PCR) 5 µl amplifikált terméket vettünk, és hozzáadunk egy új PCR reakcióhoz, most az IS 900 -IF belső primerekkel (5 'GCCGCGCTGCTGGAGTTGA 3 ') és IS 900-IR (5' AGCGTCTTTGGCGTCGGTCTTG 3 '), amelyek 210 bp-os terméket állítanak elő, ennek a PCR-ciklusnak a feltételei megegyeztek. A második amplifikációból nyert termékeket elektroforézissel 1% -os agarózgélen festettük etidium-bromidban (18).
Csak az állományhoz tartozó állatok szérumait használtuk pozitív amplifikációval a Map számára. A "Paratuberculosis Screening Ab kit" kereskedelmi rendszert (IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, ME) (19) a gyártó előírásainak megfelelően alkalmazták a technika végrehajtásához.
DNS-extrahálás székletmintákból
A 139 mintán DNS kivonási és vizualizációs eljárást hajtottunk végre. E minták közül csak 54-ben volt egyértelmű DNS-jelenlét. Az (1. ábra) néhány mintából kivont DNS-t megfigyeljük, amint ez az ábrán látható, a kapott DNS enyhe lebomlást mutat, ami nem befolyásolta a PCR technika fejlődését, egyes mintákban is értékelni lehetett az RNS jelenléte, amely normális, figyelembe véve az alkalmazott extrakciós protokollt.
Ziehl-Neelsen (ZN) folt
A minták ZN-festéssel történő elemzése során a vizsgált 139 mintából 6 pozitív volt a festés szempontjából, vagyis a Map-vel kompatibilis sav-alkohol-gyors bacillusok (2. ábra, 1. táblázat). Az A állomány esetében a 4 pozitív minta 20% -ot, míg a D-állománynál a festésre pozitív minták 4% -át figyelték meg, végül a H-állományban pozitív festési mintát kaptak, amely a teljes állomány 8,3% -át teszi ki.
A mintákkal való felhasználása előtt a PCR technikát Map törzs DNS-ével standardizálták. Ezt a DNS-t használták az összes elemzésben pozitív kontrollként. Az összes elemzett minta közül 7 pozitív eredményt hozott beágyazott PCR-ben (3. ábra). Meg kell jegyezni, hogy ez a 7 minta az A állományból származott, egybeesve három pozitív mintával ZN festés és öt ELISA vizsgálattal (1. táblázat). Ez a hét minta az összes minta 5,03% -át teszi ki; és az 1. állomány összes mintájának 35% -a, ahol nagyobb volt a Map-pozitív minták gyakorisága .
A szérumok elemzése ELISA módszerrel
Csak a Map pozitív állományok szérumait elemeztük PCR és ZN festéssel, a kapott eredményeket a 2. táblázat mutatja, ahol negatív és pozitív referenciaértékek szerepelnek. Ezen adatok felhasználásával 0,438-as határértéket állapítottak meg, amint azt Kurstak javasolta (20). Ezt az értéket figyelembe véve az A3, A18, A8, A11 és A16 minta pozitív volt. Az A11 és A18 minták esetében az eredmények egybeesnek a PCR-tesztben kapott eredményekkel.
A paratuberculosis világszerte elterjedt fertőző betegség, amely negatívan befolyásolja az állattenyésztést. Mexikóban a betegség előfordulási helyzete ismeretlen, és a kiskérődzőknél kevés jelentés található. Ebben a munkában a Map jelenlétét egy kecskeállományban jelentik Tecozautlában (Hidalgo), ez az első térképi jelentés ezen a területen. Korábban Chávez et al. (8) a Mexikó-völgyben található kecskeállományban különböző módszerek segítségével kutatást folytatott ennek a mikroorganizmusnak. Ez a munka az előzővel együtt képezi a Map első jelentését kecskékben.
Különböző módszereket dolgoztak ki egy fertőző ágens jelenlétének meghatározására a populációban, logikailag az első az izoláció; azonban számos patogén mikroorganizmus, különösen a Mycobacterium spp. nemzetség esetében, az izolálás nehéz és kockázatot jelent, mivel e nemzetség egyes fajai zoonotikusnak számítanak (10,18). Ebben a munkában közvetlen és közvetett módszereket alkalmaztak, az első esetben a PCR technikán alapuló molekuláris módszer alkalmazásáról döntöttek, amely feltárja a DNS jelenlétét a klinikai mintákban. Ennek a módszernek az az előnye is, hogy biztonságos módszer, mivel nem dolgozik közvetlenül a szerrel. Ezzel a módszertannal hét pozitív mintát azonosítottak, összesen 139-ből. A pozitív minták ugyanahhoz az állományhoz tartozó állatokból származnak, ahol 20 mintát vizsgáltak. Chávez és mtsai. (8) egyetlen 27 állatból álló állománnyal dolgozva 4 esetben izoláltak és kb. 14 hétig tartottak; esetünkben a pozitív állatok azonosítása csak két napot igényelt.