A zebra pinty embriók boncolása és feldolgozása a fejlesztés korai szakaszában
Absztrakt
A zebra pinty (Taeniopygia guttata) egyre fontosabb modellszervezetté vált számos kutatási területen, ideértve az 1., 2., 3. viselkedésmódot, valamint a memóriát és a 4,5,6-os tanulást. A zebrapintz, mint egyetlen szekvenált genommal rendelkező énekesmadár, nagy lehetőségekkel rendelkezik a fejlesztési tanulmányokban; A zebra pinty korai fejlődési szakaszait azonban nem vizsgálták jól. A zebra-pinty fejlődésének hiánya a kis petesejt és embrió boncolásának nehézségének tudható be. A következő boncolási módszer minimalizálja az embrionális szövet károsodását, lehetővé téve a morfológia és a génexpresszió vizsgálatát az embrionális fejlődés minden szakaszában. Ez lehetővé teszi az embriók fénymezőbeli és fluoreszcencia minőségű képalkotását, felhasználását molekuláris eljárásokban, például in situ hibridizációban (ISH), sejtproliferációs tesztekben és RNS extrakcióban kvantitatív vizsgálatokhoz, például REA. Kvantitatív idő-PCR (qtRT-PCR) ). Ez a technika lehetővé teszi a kutatók számára a fejlődés korai szakaszainak tanulmányozását, amelyekhez korábban nehéz volt hozzájutni.
Bevezetés
Ennek a technikának az az általános célja, hogy az embriogenezis korai szakaszából származó zebra-pinty (Taeniopygia guttata) embriókat szerezzen be, hogy a fejlesztési vizsgálatok széles körében felhasználhatók legyenek. A zebrai pintyek az uralkodó modell organizmus énekesmadárrá váltak, és széles körben használták azokat a különbözõ területeken, ideértve az 1,2-es toxikológiát, a 3-as viselkedést, a memóriát és a 4,5,6-os tanulást, az összehasonlító neuroanatómiát 7,8-at és a 9.10-es nyelvfejlõdést. A zebrapinty, mint egyetlen szekvenált genommal rendelkező énekesmadár, lehetővé teszi a Passeriformes rend genetikai és molekuláris vizsgálatát, amely az ismert madárfajok több mint 50% -át képviseli 11, 12,13.
Annak ellenére, hogy felnőtt és fiatalkori zebra-pintyeket sokféle területen alkalmaznak, kevés vizsgálatot végeztek a zebra-pinty embriókon, különösen a fejlődés korai szakaszában. Ez annak a petesejteknek és az embrióknak a kis méretének, valamint a 14,15,16 mintaszervezetként való újabb státuszának tulajdonítható, amelyekben a csirkét (Gallus gallus domesticus) korábban 17.18.19.20-ként alkalmazták. .21 uralkodó modellrendszer. Nem csókos hallgatókként azonban a csirkék nem alkalmas modellrendszer a vokális tanulás genetikai alapjainak, a vokális tanulás, az örökölhetőség, a viselkedés és a tanulásban részt vevő bazális ganglion-kortikális áramkörök tanulmányozásához.
Fontos megjegyezni, hogy a zebra pinty embriók sokkal finomabbak és könnyebben károsíthatók, mint a csirke embriók a boncolás és a molekuláris eljárások során. Különösen nagyobb gondosságra van szükség a zebra-pinty embriók permeabilizációs lépéseinek végrehajtásakor. Erős mosószerek és enzimek, amelyek nem károsítanák a csirke embriót, károsíthatják a zebra pinty embriókat. Az általános gondozás szempontjából szükséges, hogy az inkubátorba helyezés előtt a zebra-pinty tojásokat kis csészékbe rakják, hogy megakadályozzák azok törését az inkubálás során.
A zebrai pintyek viselkedéstanulmányoknak vannak kitéve, fogságban egész évben könnyen és szaporodva reprodukálódnak, és hangosan tanulnak. Ezek a tulajdonságok lehetővé teszik a zebra pinty használatát annak a modellszervezetnek az igényére, amely integrálja a nyelv fejlődési, genetikai és viselkedési aspektusait. Az alábbiakban részletezett boncolási módszerek, valamint a közelmúltban kifejlesztett zebra-pinty-specifikus stádium-útmutató 22 teszik a zebra-pintyet egyre hasznosabb szabványosított organizmus-fejlődési modellvé. Az embriók megszerzése a korai szakaszban azonban ijesztő lehet. Ez a protokoll lehetővé teszi a kutatók számára, hogy könnyen megszerezzék a korai stádiumú embriókat. A zebra-pinty komplex viselkedésének korai fejlődését és molekuláris fejlődésének alapját, vagy más kisméretű madár madarak fejlődésének toxikológiai hatásait vizsgáló tanulmányok hasznosnak találják ezt a boncolási módszertant.
Jegyzőkönyv
Etikai nyilatkozat: A módszereket a William és Mary Főiskola tenyésztelepének háziasított zebra pintyén hajtották végre. Minden eljárás követte az RSPCA 23 irányelveit, és a William és Mary College OLAW (Laboratóriumi Állatvédelmi Iroda) Állatvédelmi Biztosítója (# A3713-01) hagyta jóvá, és az Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottság (IACUC) jóváhagyásával rendelkezett (# 2013-06 -02-8721-dacris).
1. Tojásgyűjtés és inkubálás
2. Az embrió eltávolítása a petesejtből
3. Az embriók elválasztása az extra-embrionális szövetektől
4. EdU sejtproliferációs vizsgálat. Az EdU beépítése és kimutatása Zebra Finch embriókban.
5. Az EdU kattintson a Reaction Protocol elemre
A következő lépéseket üvegüvegeken hajtják végre.
Reprezentatív eredmények
A boncolás előtt az EdU-t a 2. napon egy tojásba injektálják, és egy éjszakán át inkubálják. A 16 22 stádiumú embrió boncolása és rögzítése után az EdU-t "click" kémia segítségével vizualizálták, lehetővé téve a szaporodó sejtek detektálását 6. ábra (A, B, C). Fontos, hogy gondosan figyelemmel kísérjük az időpontokat, amikor a tojásokat az inkubátorba helyezzük, és a boncolások során, mivel a metilhiganynak való kitettség vagy az EdU assay végrehajtása megzavarhatja a fejlődés progresszióját. Az injekciót a 0. nap korai szakaszában végeztük, amely a betakarítás napja volt az 1.3 lépésben leírtak szerint. Ezt az embriót kb. 38 órával később boncoltuk (7-22. Szakasz). A túlélési arány körülbelül 90% -os volt (azonos sebességgel, mint a kontroll embrióké), amíg az injekció mennyisége 478 nl alatt volt.
Ez a módszertan lehetővé teszi a boncolást a kiváló minőségű RNS kivonása céljából is. A 16-os stádiumú 22 embriók boncolása után RNS-extrakciót hajtottunk végre a gyártó protokollja szerint, optimalizálás nélkül, amint azt a 7. ábra. A sárgája membránjának eltávolítása felesleges volt az RNS extrakcióhoz és az azt követő QRT-PCR alkalmazásokhoz.