Alacsony fehérjetartalmú gabonafajok globulin tároló fehérje
Tárgyak
Összegzés
Bevezetés
Anyagok és metódusok
Betegek és szérumok
Fehérjekivonások
50 mg/s teljes fehérjéket extraháltunk a B. distachyon Bd21 vonalának tiszta, aprított magjából Dupont és mtsai. 13 protokollja szerint. Röviden: egy 2% SDS-t, 10% glicerint, 50 mM DTT-t és 40 mM Tris-HCl-t (pH 6,8) tartalmazó SDS-Tris extrakciós puffert (pH 6,8) alkalmaztunk a teljes fehérje extrahálásához szobahőmérsékleten egy órán át, rendszeres enyhe dózis. örvény. Az extraktumot 16000 g-vel 15 percig centrifugáltuk. A felülúszót négy térfogat jéghideg acetonnal kicsapjuk. Öt biológiai másolatot alkalmaztunk az extrakciós folyamatban.
2D gélelektroforézis és immunblotolás
Csapás után az üledéket IEF pufferrel (8 M karbamid, 2% CHAPS, 100 mM DTT, 0,2% CA és 0,1% bróm-fenol kék) oldjuk. Az izoelektromos fókuszálást 7 cm-es Immobiline DryStrips pH 7-10-ben (GE Healthcare) hajtottuk végre, rehidratációs körülmények között, egy éjszakán át 200 ug fehérjével és 150 µl IEF pufferrel. 12% poliakrilamid géleket alkalmaztunk a fehérjék molekulatömegük szerinti szétválasztására. A 2D GE-t három technikai másolatban készítettük. Mivel a különböző biológiai és technikai replikákból származó 2D fehérje minták megegyeztek, a végső inline nano-LC-MS/MS-t három 2D GE technikai replikából hajtottuk végre, és a foltokat egyesítettük.
Miután a GE 2D fehérjéket átvitték az ImmobilonP PVDF membránra (Millipore, Billerica, USA), és 1 órán át blokkolták 5% BSA-val és 0,05% TWEEN20-mal, majd egy éjszakán át inkubálták 4 ° C-on, 1:20 hígított vérszérummal. Az immunreaktív fehérjéket kecske anti-humán IgA peroxidáz konjugált antitesttel (Sigma-Aldrich-A0295) detektáltuk kromogén peroxidáz szubsztrát 4-klór-1-naftol jelenlétében. Az immunválasz fehérjefoltokat kivágtuk és fehérje-azonosítás céljából online nano-LC-MS/MS alkalmazásával elküldtük. Rizs glutelin antitestet és nyúl anti-IgA másodlagos antitestként alkalmaztunk a 2D Western blot analízisben a vetőmagot tároló globulinok jelenlétének megerősítésére 14 .
Fehérje-azonosítás nano-LC-MS/MS segítségével online
Szekvenciaelemzés és epitóp-előrejelzések
Eredmények
( NAK NEK ) - A beltenyésztett Bd21 vonal teljes fehérjekivonatának 2D gélelektroforézise. A fehérjéket 3-10 pH-értékű IPG-csíkokon választottuk szét, majd 12% -os akrilamid-géleken. A jelölt fehérje foltok immunreaktív fehérjéket képviselnek, és beküldtük on-line nanoLC-MS/MS elemzésre. A molekulatömeg-tartomány a bal oldalon van jelölve. ( nak nek F ) - reprezentatív immunblotok naiv cöliákiás betegek IgA-reaktív szérumainak felhasználásával ( - HLA DQ2, C - HLA DQ8, D - HLA DQ8/X), a terápia Crohn-kórban szenvedő ileokolikus betegeket érintett ( ÉS ), HLA DQ2 lisztérzékenységben szenvedő beteg gluténmentes étrendben és egészséges kontrollban ( G ). H: A teljes fehérjekivonat Western blot-analízisét rizs-glutelin 12-vel és nyúl-ellenes IgA antitestekkel (Sigma-Aldrich) alkalmaztuk másodlagos antitestként.
Teljes méretű kép
Teljes méretű asztal
Két 7S globulint (Uniprot ID I1GPS5 és I1GMC8) főleg a foltokból azonosítottak. Az I1GPS5-et 14 fehérjepont elsődleges találataként ismerték el. Ez a fehérje mutatta a legnagyobb hasonlóságot a Globulin-3 és a Globulin-3A búzatároló fehérje homológjaival (Uniprot ID B7U6L4 és I6QQ39). Az I1GMC8-at két fehérjefoltban azonosítottuk, és a legnagyobb szekvencia-hasonlóságot mutatta a Triticum urartu-ból (M7ZQM3) azonosított Globulin 1S-szerű fehérjével. Az I1HNH9 Brachypodium fehérje mutatta a legnagyobb homológiát egy 11S globulinnal (A. sativa Q38780). Az I1HMK7 és I1IPF2 fehérjéket 12S globulinként azonosítottuk, a legnagyobb hasonlóságot mutatva az A. sativa 12S magtároló fehérjéivel (P12615 és P14812). A szérum gyakrabban reagált a Globulin-3A (69,23% - I1GPS5) búzatároló fehérje és a 11S és 12S típusú globulinok (76,92% - I1HNH9 és I1HMK7) homológjára. Az alacsony molekulatömegű gluteninnel (69,23% I1HMR6) hasonló homológ szintén rendkívül reaktív immunrendszer volt a lisztérzékenységben szenvedő betegek szérumaival szemben.