Atomi bázisok a kálium neuroncsatornák terápiás aktiválásához.

terápiás

  • Tárgyak
  • Összegzés
  • Bevezetés
  • Eredmények
  • A KCNQ csatornák retigabin modulációja egy Trp S5 segítségével
  • A KCNQ3 csatornák természetellenes aminosav-mutagenezise
  • A retigabin hatások elvesztése a Trp265 H kötés eltávolítása után
  • A Trp265-retigabin kölcsönhatás erősségének finomhangolása
  • A feltételezett gyógyszerkötő maradékok relatív hozzájárulása.
  • Valószínű H-kötő donor azonosítása retigabinban
  • Vita
  • Mód
  • Molekuláris biológia és in vivo ostobaság elnyomása
  • Kételektródás feszültségbilincs felvételek
  • A retigabin megkötésének molekuláris szimulációi
  • Adatelemzés
  • Kiegészítő információk
  • PDF fájlok
  • Kiegészítő információk
  • Hozzászólások

Tárgyak

  • Ion csatornák
  • Membránfehérjék
  • Molekuláris biofizika

Összegzés

Bevezetés

Az epilepszia gyakori, heterogén és gyakran gyengítő rendellenesség, amely a világ népességének körülbelül 1% -át érinti. Az epilepsziában szenvedő betegek jelenlegi klinikai kezelése főként gyógyszeres kezeléssel történik, bár általánosan elfogadott vélemény, hogy az újonnan diagnosztizált epilepsziás betegek ∼ 30% -a rezisztens lesz a szokásos 1, 2 antikonvulzív szerekkel szemben. Ezenkívül az említett ellenállás összefügg a támadás típusával; például arról számoltak be, hogy a fokális epilepsziában szenvedő betegek 60% -ánál kialakul és fenntartódik a gyógyszerrezisztencia 3. Ezek a hiányosságok motiválták az új epilepsziaellenes gyógyszerek keresését, az epilepszia rendhagyó kezeléseit (például a ketogén diéta), valamint az új farmakológiai célok folyamatos azonosítását és validálását 4, 5, 6, 7 .

Természetellenes aminosav-mutagenezist alkalmaztunk az atomok és az elektronok finoman átrendezésére a Trp oldalláncon a retigabin kötési helyén. Megállapításaink azt mutatják, hogy a KCNQ3 Trp265 indol-nitrogénatomjának újrapozícionálása teljesen megszünteti a retigabin hatásait, ami arra utal, hogy a retigabin kölcsönhatásához H-kötés szükséges a Trp265-tel. Ennek a H-kötés kölcsönhatásnak a fontosságát tovább szemlélteti a fluorozott Trp-analógok bevezetése (nagyobb hajlandósággal a H-kötésekre) a KCNQ3 Trp265-be, ami megnöveli a gyógyszer hatékonyságát. Több retigabin analóg felhasználásával azonosítottunk egy elektrosztatikus ujjlenyomatot egy H-kötés akceptor körül, amely korrelál a gyógyszer hatékonyságával. Ezek a kísérleti korlátok meghatározzák a retigabin kölcsönhatásaiban részt vevő specifikus atomokat és kémiai erőket, és kiemelik azokat a megközelítéseket, amelyek felhasználhatók a meglévő gyógyszerek racionális fejlesztésének irányításához.

Eredmények

A KCNQ csatornák retigabin modulációja egy Trp S5 segítségével

( nak nek, ) Vezetőképesség-feszültség kapcsolatok ( nak nek ) KCNQ2 (n = 3) és KCNQ2 [Trp236Phe] (n = 6), és ( ) KCNQ3 * (n = 5) és KCNQ3 * [Trp265Phe] (n = 3) homomer csatornák a jelzett mutánsokkal együtt (retigabin-koncentráció 100 µM). ( c ) KCNQ2 és KCNQ3 heteromer kombinációinak vezetőképesség-feszültség összefüggései (az injektált mRNS aránya 1: 1, Trp → Phe mutációkkal vagy anélkül, ahogyan jeleztük, n = 5 mindegyik kombinációhoz), csökkentett retigabin kötődésű csatornák létrehozására oldalak. ( d ) A 100 μM retigabin telítettség V 1/2 változásainak összefoglalása a KCNQ2 Trp236 és a KCNQ3 Trp265 mutációkban a jelzettek szerint (* P 19, 20 .

Kipróbáltuk, hogy a KCNQ3 Trp 265 pozíció szerepet játszik-e a PIP 2 csatornára adott válaszok szabályozásában. A PIP 2 hidrolizálásához a depolarizált feszültségekhez a feszültségérzékeny foszfatáz ciona zarnuis feszültségérzékeny foszfatáz (CiVSP) segítségével pulzáltuk a petesejteket egy előimpulzus feszültségtartományon keresztül, amelyet egy -20 mV tesztimpulzus követett, hogy értékeljük a csatorna aktivitását a PIP 2 kimerülése után 27 . Hasonló csatornacsökkenést figyeltünk meg a depolarizációs feszültség lépéseivel a KCNQ3 * és a KCNQ3 * [Trp265Phe] csatornákon, jelezve, hogy a Trp265 nem befolyásolja szignifikánsan az anionos foszfolipidek csatornaműködésre gyakorolt ​​hatását (1e., F. Ábra). Összességében ezek az eredmények azt illusztrálják, hogy a KCNQ3 Trp265 maradvány elengedhetetlen a retigabin hatásaihoz, de nem játszik jelentős szerepet a csatorna aktiválásának feszültség vagy PIP 2 általi szabályozásában. .

A KCNQ3 csatornák természetellenes aminosav-mutagenezise

A retigabin és a Trp ezen esszenciális mellékláncának kölcsönhatásainak mögöttes mechanizmusának vizsgálatához természetellenes aminosav-mutagenezist alkalmaztunk kissé megváltozott Trp-variánsok bevezetésére (2a. Ábra). Ezzel a módszerrel egy stop kodont (TAG) helyeznek az ioncsatorna génjébe egy érdekes helyen, és ezt az mRNS-t együtt injektálják a Xenopus laevis oocitákba egy szintetikus aminosav acilezett tRNS-sel együtt (amely nem aminosavat tartalmaz) ). természetes), amely merőleges a szintetikus Xenopus tRNS 28 útvonalakra. Amikor a riboszomális transzlációs gép találkozik a bevitt TAG stop kodonnal, a komplementer szintetikus tRNS (egy CUA antikodonnal) lehetővé teszi a hozzáadott aminosav leolvasását és beépítését teljes hosszúságú ioncsatornákba (2a. Ábra) 29 .

A retigabin hatások elvesztése a Trp265 H kötés eltávolítása után

A feltételezett gyógyszerkötő maradékok relatív hozzájárulása.

( nak nek ) Vezetési-feszültség viszonyokat gyűjtöttünk a jelzett KCNQ3 * mutáns csatornákhoz (n = 4-6 per mutáns) 0, 100 vagy 300 µM retigabinban. ( ) ΔV 1/2 maximum 300 μM retigabinban, minden mutáns csatornában mérve. A hiba sávok vannak nak nek, képviselje sem ( c ) A retigabint a KCNQ3 pórusképző doménjének molekuláris modelljéhez kapcsoltuk (lásd a 19. hivatkozást). Két orientáció látható a karbamátcsoporttal a Leu314 („eredeti” modell) vagy a Trp265 („flip” modell) közelében. A két kötési minta átfedésben van az „átfedésben”, megmutatva a mindkét gyógyszer-orientáció által elfoglalt hasonló helyet.