AZ AFLATOXIN B1 KOMBINÁLT TOXIKUSSÁGÁNAK VIZSGÁLATA A B1 AFLATOXIN ÉS OCHRATOXIN KOMBINÁLT TOXIKUSSÁGÁVAL

AZ AFLATOXIN B1 ÉS AZ OCRATOXIN A KOMBINÁLT TOXIKUSSÁGÁNAK VIZSGÁLATA IN VITROBAN ÉS IN VIVO MODELLEKBEN AZ AFLATOXIN B1 ÉS AZ OCHRATOXIN A TOXICITÁSÁNAK VIZSGÁLT IN VITROBAN ÉS VIVO MODELLJEKBEN Laura Ana Corcuera Martínes DOKTOR

toxikusságának

Az AFLATOXIN B1 ÉS AZ OCRATOXIN A KOMBINÁLT TOXICITÁSÁNAK VIZSGÁLATA IN VITROBAN ÉS IN VIVO AZ AFLATOXIN B1 ÉS OCHRATOXIN A IN VITRO ÉS VIVO MODELLEK ÖSSZETETT TOXICITÁSÁNAK MINTÁI a Navarrai Egyetemet az Élelmiszertudományi, Élettani és Toxikológiai Tanszéken Dr. Adela López de Cerain Salsamendi és Dr. Elena González-Peñas Pamplona vezetésével, 2012. április Dra. Adela López de Cerain Salsamendi Dra. Elena González-Peñas

Ezt a munkát a következő projektek finanszírozták: Mikotoxinok: az ochratoxin A és az aflatoxin B1 kombinált kezelésének toxicitása in vitro és in vivo modellekben Spanyol Kormány Tudományos és Innovációs Minisztériuma Hivatkozás: AGL2008-01437/ALI A toxinok jelenléte a élelmiszer és szerepvállalása az emberi egészségben CAN Alapítvány Hivatkozás: 10829

A családomnak Pamplonából (Begoña), Miguel, Lander, Javier, Jose, Asier, Txikitin, María, Manolo. amiért ennyire szeretettel fogadtam és otthon éreztem magam. Ibannak, hogy minden lépést velem tett ezen az úton, felállt, amikor leesem, és a türelmét. Köszönöm, hogy ennyire szeretsz és olyan jól megértesz. Ez a tézis is a tiéd, és a jövő a miénk. A családomnak, hogy törődik velem. Ama, nagyi és nagypapa, akik látták a kezdetet és az égből, látják a végét. Al Yayo, aki élvezheti ezt a diadalt velem. Ignacio és Begoña nagybátyáimnak, Maríának. Luis bátyámnak köszönöm a biztatást, a kíváncsiságot és a rajongást, arra késztet, hogy minden nap jobb legyek. Semmi sem lett volna lehetséges szüleim, életem oszlopai nélkül. Köszönöm, hogy megtanítottad, hogy a jól végzett munka maga a siker. Köszönöm a szeretetét, hogy hitt bennem, és tudatta velem, hogy tudok. Ez a te nyereményed is. KÖSZÖNET MINDENKINEK! 9.

A szüleim A Iban Azért kapták, mert nem tudták, hogy ez lehetetlen Jean Cocteau

Rövidítések/rövidítések RÖVIDÍTÉSEK/RÖVIDÍTÉSEK 3-ADON: 3-acetildeoxinivalenol/3-acetildeoxynivalenol 8-oxo-dG: 8-oxoguanine/8-oxoguanine 15-ADON: 15-acetildeoxynivalenol/15-acetyldeoxynivalenol/15-acetyldeoxynivalenol1-Fotel1Ben111Benden1Fotel1Ben1Ben111Bend1Ben11Fen11Ben1Ben11Benten1Bet1Ben1Ben11Fen1Ben1Ben1Ben1Bent1Ben1Fen11Ben1Ben1Bent1Ben1Ben1Fen1Ben1Ben1Fen1Ben1Ben1Bent1Fen1Ben1BenFen1Ben1Ben1: F1/AFB1-formamidopirimidin AFB2: Aflatoxin B2/Aflatoxin B2 AFBO: AFB1-exo-8,9-epoxid/AFB1-exo-8,9-epoxid AFG1: Aflatoxin G1/Aflatoxin G1 AFG2: Aflatoxin G1 AFG2: Aflatoxin G1 AFG2: Spanyol Ipari Gyógyszerészeti Szövetség AOAC: Nemzetközi Analitikai Kémikusok Szövetsége/Hivatalos Analitikai Kémikusok Szövetsége AP hely: Apirimidin vagy apurinic hely AU: Önkényes egységek testtömeg: Testtömeg CIT: Citrinina/Citrinin CV: Variációs koefficiens DCFH-DA: Dihidrodiklórfluoreszcein-diacetát/Dihidrodiklór-fluoreszcein-diacetát DL 50: Halálos adag 50 DON: Deoxinivalenol/Deoxynivalenol DTI: Napi tolerálható bevitel EC: Európai Bizottság/Európai Bizottság EFSA: Európai Biztonsági Hatóság Alimentaria/Európai Élelmiszerbiztonsági Hatóság 13

Rövidítések/rövidítések OECD: Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet/Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet OTA: Ochratoxin A/Ochratoxin A PBS: Foszfátpuffer/Foszfátpufferolt sóoldat pc: Testtömeg PECE: Polifenollal dúsított kakaó kivonat/polifenol dúsított kakaókivonat pk a: Sav disszociációs állandó RE: Viszonylagos hiba SCF: Az Európai Bizottság Élelmiszerügyi Tudományos Bizottsága/Élelmiszerügyi Tudományos Bizottság SCOOP: Tudományos együttműködés élelmiszer-kérdésekben/Tudományos együttműködés az élelmiszerekkel kapcsolatos kérdésekben) RF: Relatív fluoreszcencia ROS: Reaktív oxigénfajok/Reaktív oxigénfajok RSD: Standard deviáció/Relatív standard deviáció SE: Standard hiba t 1/2: eliminációs felezési idő/eliminációs felezési idő T-2: Toxin T-2/T-2 toxin TWI: tolerálható heti bevitel UA: Önkényes egységek UHPLC-LD: Ultra magas folyadékkromatográfia oldat ultraibolya detektorral/Ultra nagy teljesítményű folyadékkromatográfia-fluoreszcencia detektor UV: Ultraibolya detektor WHO: Egészségügyi Világszervezet/Egészségügyi Világszervezet ZEA: Zearalenone/Zearalenone 15

TARTALOM/TARTALOM 1. fejezet/1. fejezet Általános/általános bevezetés Bevezetés 17 2. fejezet Célok, célkitűzések és vázlat 55 3. fejezet Az okratoxin A csökkenti az üstökösvizsgálattal kimutatott aflatoxin B1 által kiváltott DNS-károsodást a Hep G2 sejtekben 61 4. fejezet A polifenollal dúsított kakaó kivonat csökkenti a mikotoxinok által termelt szabad gyököket 85 5. fejezet UHPLC-FLD analitikai módszer validálása az aflatoxin B1 és az ochratoxin A egyidejű meghatározására patkány plazmában, májban és vesében 109 6. fejezet Az aflatoxin B1 és ochratoxin A toxicitásának és toxikokinetikájának megközelítése F344 patkányok egyidejű orális beadása után 135 7. fejezet Az Ochratoxin A csökkenti az aflatoxin B1 genotoxicitását: Az in vivo micronucleus és az üstökös vizsgálat egyidejű alkalmazása 159 8. fejezet Általános vita 187 9. fejezet/9. fejezet Következtetések/Következtetések 207 17

1. Fejezet/1. Fejezet Általános bevezetés/Általános bevezetés

1. fejezet/1. fejezet AFLATOXIN B1 Kémiai tulajdonságok Az AFB1 a difurán-kumarin családba tartozik. Szisztematikus nómenklatúrája: 2,3,6aα, 9aα-tetrahidro-4-metoxi-ciklopenta [c] -b-furo [2 ', 3': 4,5] furo [2,3-h] kromén-1,11-dion A C 17H 12O 6 molekulatömege 312,27 g/mol. Kémiai szerkezetének kis eltérései a természetben megtalálható aflatoxinok halmazát eredményezik (AFB1, AFB2, AFG1 és AFG2). Az AFB1 a legmagasabb koncentrációjú, ezt követi az AFG1, AFB2 és AFG2. Ezeknek az anyagoknak az akut és krónikus toxicitásuk tekintetében történő követési sorrendje az AFB1> AFG1> AFB2> AFG2, és közvetlenül összefügg azzal, hogy epoxidot képezhetnek a 8-9 kettős kötésnél (az ábrán piros nyíllal jelölve), és a ciklopentenon gyűrűkhöz (kék nyíl) társult hatásosság (McLean és Dutton, 1995). Az M1 és M2 aflatoxinok a B1 és B2 aflatoxinok oxidatív metabolizmusának hidroxilezési termékei. 1. ábra: A természetben jelen lévő aflatoxinok (EFSA, 2007) 24

Általános bevezetés/Általános bevezetés, amely indukálja a 8-OHdG képződését patkány és kacsa májban. Ez a DNS-károsodás indukálhatja a G> T transzverziót, ami hozzájárulhat az AFB1 karcinogenitásához (Bedard és Massey, 2006). 4. ábra: Az AFB1-DNS addukt evolúciója (Smela et al., 2002) 31

1. fejezet/1. fejezet, hogy az OTA fenolos formájában (OTA -) fenoxónium-kationtá alakul (8. ábra, J), amely viszont OTAQ -vá (8. ábra, K) alakul át (Ringot et al., 2006; Dai et al., 2002). Másrészt az OTA ismételt beadása képes jelentősen csökkenteni az intracelluláris antioxidánsok, például a glutation (GSH), a szuperoxid-diszmutáz (SOD), a kataláz (CAT) vagy a glutation-peroxidáz (GSPx) szintjét a májban és a vesében (Meki és Hussein, 2001) és fokozza a lipidperoxidációt (Khan és mtsai, 1989). A szerkezet-aktivitás vizsgálatok szerint a klóratom elengedhetetlen az OTA genotoxikus hatásához, mivel a DNS-károsodást kiváltó klórozott vegyületek előzetesen bioaktivációs folyamaton mennek keresztül a benzokinonok számára (Ringot és mtsai, 2006). 8. ábra: ROS-képződés OTA-val (Ringot et al., 2006) A génexpressziós vizsgálatok kimutatták, hogy az OTA intenzívebben képes csökkenteni az intracelluláris oxidatív védelemben részt vevő gének expresszióját a májban, mint a vesében (Cavin és mtsai. 2007; Arbillaga et al., 2008); és ez növeli a nitrogén-oxid szintetáz 40 expresszióját