Máj-irányított géntranszfer humán hepatoblastoma sejtvonalban és in vivo

Összegzés

Hozzáférést a

Fő

A vírusvektorok fő korlátai, különösen azok, amelyek a biztonsággal és az immunogenitással kapcsolatosak, tanulmányokat vezettek a nem vírusos génbejuttatási módszerek fejlesztésére. Az ilyen nem vírusos vektorok közül a kationos liposzómák az egyik legígéretesebb nem vírusos rendszer a génterápiában. 2 A funkcionális terápiás gének hatékony bejuttatása a célsejtekbe nagy problémát jelent a génterápiás megközelítésekben a rák és anyagcsere-betegségek, valamint az emberi immunhiányos vírusfertőzés kezelésében.

Feltételezzük, hogy a kationos SG liposzómák és a DNS elektrosztatikus interakciója nem volt elegendő ahhoz, hogy lehetővé váljon egy kis részecskeméretű liposzóma/DNS komplex képződése. Ezért nagyon pozitív töltésű, kis méretű liposzómákat terveztünk, amelyek a DNS-t tartalmazó vizes fázissal történő összekeverés után DNS-sel tölthetők fel, ami egy kis liposzóma/DNS komplex képződését eredményezi. A máj kiválasztásához liposzómákat készítünk, amelyek β-szitoszterint β-D-glükozidot (Sit-G) tartalmaznak, amely az SG (Sit-G liposzómák) fő alkotóeleme. A liposzómák pozitív töltésének növelése érdekében kationos lipidekként választottuk a Tfx-20 (Tfx) és a 3β [N- (N ', N' -dimetilaminoetán) -karbamoil] koleszterin (DC-Chol) reagenst, mert az előbbi szintetikus kationos lipidvegyület [[N, N, N ', N' -tetrametil-N, N '-bis (2-hidroxi-etil) -2,3-di (oleoil-oxi) -1,4-bután-diamónium-jodid], magas szintű A transzfekció hatékonysága a 13. sejtvonalakban, és ez utóbbit már klinikailag használták a génterápiában. 14, 15 A kis liposzómák előállításához a módosított etanol injekciós módszert alkalmazzuk.

Ebben a tanulmányban kis erősen pozitív töltésű Sit-G liposzómákat készítünk, optimalizáljuk a luciferáz riporter gént kódoló plazmid DNS és a Sit-G liposzómák arányát azáltal, hogy értékeljük a transzfekció hatékonyságát HepG2 sejtekben szérum jelenlétében a táptalajban, a Sit-G DNS/liposzóma komplex gén expresszióját vizsgálták egerek intravénás injekciója után.

A magas, 0,8 pozitív (33,8 ± 7,0 mV) potenciállal rendelkező Sit-G liposzómákról (78 ± 2 nm) mikroszkópos megfigyeléssel kerek alakúnak bizonyult (az adatokat nem mutatjuk be). A Sit-G liposzómaszuszpenzió nagyon stabil volt, és több hónapig 4 ° C-on tárolható a szemcseméret változása nélkül (az adatokat nem mutatjuk be). A Sit-G liposzóma/DNS komplexek részecskemérete és potenciálja a kationos lipid és a DNS töltésarányától (+/-) függ (1. ábra). Körülbelül 3 töltöttségi aránnyal (+/-) a komplex legnagyobb átlagos szemcseméretét és varianciáját (1200 ± 247 nm) figyeltük meg, amikor a potenciális megközelítés megközelítette a nullát (0,1 ± 0,3 mV). A 3-as töltési arány kivételével a liposzóma/DNS-komplex részecskemérete körülbelül 100–250 nm volt.

hepatoblastoma

Teljes méretű kép

A DNS és a Sit-G liposzómák arányának optimalizálása érdekében a riporter gén expresszióját Sit-G liposzómákkal transzfektált HepG2 sejtekben vizsgáltuk, különböző töltési arányokban (+/-) tápközegben szérummal vagy anélkül (2. ábra). A Sit-G liposzóma/DNS komplex magasabb transzfekciós hatékonyságával járó terhelési arányt (+/−) 3-ról 4-re változtattuk 10% -os szérum hozzáadásával a táptalajhoz. 1 órás szérumot tartalmazó táptalajban történő inkubálás után a liposzóma/Sit-G DNS-komplex részecskemérete 4-es terhelési aránynál (+/−) 240 ± 16 nm-ről körülbelül 3 μm-re nőtt, és a potenciális de 27,9 ± 5,1 mV –8,9 ± 2,1 mV. A szérum különböző komponensei, például a szarvasmarha szérum albumin (BSA), a heparin, az immunglobulin G és a lipoproteinek megváltoztatják a liposzóma/DNS komplex potenciálját pozitívról negatívra vagy semlegesre. 16, 17 Ezért a liposzóma/DNS komplex szérumtartalmú tápközegben felesleges pozitív töltést igényelhet, ami a töltési arány növekedését eredményezi (+/-) a nagy transzfekciós hatékonyság érdekében, 3-tól 4-ig.