A B-myb lin-9 komplexet toboroz a g2m gén transzkripció aktiválásához a karcinóma sejtekben

lin-9

  • Összegzés
  • Bevezetés
  • Eredmények
  • Az egér embrionális karcinóma sejtjeiben a Lin-9 kimerülése mitotikus hibát tár fel
  • A Lin-9 szükséges a G 2/M gén transzkripciójához
  • A Lin-9 társul a B-Myb-kel, de nem az F9 sejtek zsebfehérjéivel
  • Az F9 sejtek tartalmaznak egy LINC-szerű komplexet, amely B-Myb és Lin-9-et tartalmaz
  • A Lin-9 és a B-Myb megköti és aktiválja a G 2/M gének promotereit
  • A Survivin promóter specifikus kötőhelyei elengedhetetlenek a Lin-9 és a B-Myb kötéséhez
  • Vita
  • Összeférhetetlenség
  • Kiegészítő információk
  • Képfájlok
  • Kiegészítő ábra S1
  • Kiegészítő ábra S2
  • Kiegészítő ábra S3
  • Word dokumentumok
  • Kiegészítő ábrák Jelmagyarázat
  • Kiegészítő anyagok és módszerek
  • Excel fájlok
  • Kiegészítő információk

Összegzés

Bevezetés

Ebben a tanulmányban a Lin-9/B-Myb kölcsönhatást vizsgáltuk F9 egér embrionális karcinóma (CE) sejtekben, amelyek a korábban vizsgált sejtektől eltérően csak a G 2/M átmenetnél vannak szabályozva. az őssejteket (ES) (White és mtsai, 2005), az Rb, p107 és p130 zsebfehérjéket hiperfoszforilált állapotban tartják. Következésképpen nincsenek represszív E2F komplexek és hiányzik a sejtciklus-szabályozás a G 1/S-ben. Megmutatjuk, hogy a Lin-9 expresszió RNS interferenciával történő szuppressziója megállást okoz a mitózisban, és ezt a rendszert használjuk a Lin-9 transzkripciós célok detektálására. . Később a Lin-9 és a B-Myb kimutatták, hogy együttműködnek a kulcs G2/M gének transzkripciós aktivátoraként. Végül egy F-sejtekben azonosítottunk egy B-Myb komplexet, amely tartalmazza a LINC-ben korábban azonosított komponensek nagy részét. Lényeges, hogy a differenciálatlan F9 sejtekben nem tapasztaltunk összefüggést a zsebfehérjék és a LINC között, ami azt bizonyítja, hogy a sejtciklust B-Myb/LINC komplex szabályozza csak a G 2/M átmenetben.

Eredmények

Az egér embrionális karcinóma sejtjeiben a Lin-9 kimerülése mitotikus hibát tár fel

A Lin-9-et az egér Lin-9 ellen irányított rövid hajtű RNS-t (shRNS) kódoló pSuper vektorok transzfektálásával kimerítettük az F9 sejtekből. A kontroll sejteket pSuper-rel transzfektáltuk, amely expresszál egy luciferáz shRNS pGL3-at. Kvantitatív PCR (qPCR) kimutatta, hogy a Lin-9 shRNS 71% -kal szignifikánsan csökkentette a Lin-9 expresszióját (P

A Lin-9 kimerülése az F9 embrionális karcinóma sejtekben mitotikus hibát tár fel. ( nak nek ) A Lin-9 expresszió kvantitatív RT-PCR elemzése Lin-9 kimerült sejtekben a kontroll sejtekhez viszonyítva. Az expressziót riboszomális ARPP0 értékre normalizáltuk. ( ) Lin-9, B-Myb és Cyclin B1 Western blot analízise shRNS GL3-mal (kontroll), shRNS Lin-9 (Lin-9) és shRNS Lin-9-vel transzfektált shRNS-rezisztens pCAGGS-Lin - 9R vektorral transzfektált F9 sejtekben (mentés). A Β-aktint használtuk terhelés kontrollként. ( c ) A Lin-9-től kimerült sejtek áramlási citometriai analízise (FACS), kontroll és mentés propidium-jodiddal (PI) festve. A nyíl 8n DNS-tartalmú sejteket jelöl. ( d ) Anti-hiszton H3 (foszfo S10) -FITC-vel festett és PI-vel festett Lin-9 kimerült mentő és kontroll sejtek FACS elemzése. A mitózisban lévő sejtek dobozosak, és a mitotikus index a sejtek százalékában jelenik meg. A nyíl azt mutatja, hogy a 8n DNS-t tartalmazó sejtek mitózison mennek keresztül.

Teljes méretű kép

Annak megállapítására, hogy a Lin-9-ben kimerült sejtek felhalmozódtak-e G2-ben vagy mitózisban, a sejteket FACS-sel és konfokális mikroszkóppal elemeztük. A mitotikus index meghatározásához az FACS-t olyan sejtekkel végeztük, amelyeket H3-foszfoszerin 10 hiszton (H3-foszfoS10) antitesttel festettünk, amely a mitózis markere (Paulson és Taylor, 1982). A Lin-9 kimerült sejtek megnövekedett mitotikus arányt (16,21%) mutattak a kontroll sejtekhez (3,59%) és a mentő sejtekhez (3,10%; 1d. Ábra) képest. További 8n DNS-t tartalmazó sejtpopulációt figyeltek meg a Lin-9 kimerülésében, és ezek a sejtek pozitívan festődtek a H3-foszfoS10-re, jelezve, hogy mitózisban vannak. A β-tubulinnal és DAPI antitesttel festett sejtek konfokális mikroszkópiája magasabb mitotikus arányt mutatott (14,42%) a Lin-9 kimerült sejtekben, összehasonlítva a kontroll (3,38%) és a mentősejtekkel (3,07%; S2 kiegészítő ábra). A Lin-9 kimerült sejtek egyedi sejtmagokat tartalmaztak, és a mitózis során bipoláris orsót képeztek, ami azt jelzi, hogy a 4n és 8n sejtek felhalmozódása a mitózis kudarcának, nem pedig az orsó hibás képződésének vagy a citokinezis kudarcának volt köszönhető.

A Lin-9 szükséges a G 2/M gén transzkripciójához

A Lin-9 szükséges a G 2/M gének újraszabályozásához az embrionális őssejtekben. ( nak nek ) A Lin-9 depletált F9 embriósejtekben szabályozott G2/M gének táblázata cDNS mikroarray elemzéssel meghatározva. A Lin-9 expressziós szintje csökkent a Lin-9 kimerült F9 sejtekben. ( ) A Lin-9 célgének Lin-9 kimerült sejtekben végzett kvantitatív RT-PCR elemzése a kontroll sejtekhez viszonyítva, a mikroarray adatok igazolásához. A kifejezést ARRP0 értékre normalizáltuk .