A kettős humanizált TK-NOG egérmodell létrehozása a HIV-hez társuló máj patogenezishez

Összegzés

Ez a protokoll megbízható módszert biztosít humanizált egerek létrehozására az emberi immunrendszerrel és a májsejtekkel. Az emberi hepatociták és a CD34 + hematopoietikus őssejtek intrasplenikus injekciójával elért helyreállított kettős immunhiányos egerek hajlamosak az emberi immunhiányos vírus-1 fertőzésre és a HIV-fertőzött betegeknél megfigyelt összesített májkárosodásra.

Absztrakt

Bevezetés

Az antiretrovirális terápia megjelenése óta jelentősen csökkent a HIV-1 monoinfekcióval összefüggő halálozások száma. A májbetegség azonban a HIV-fertőzött betegek 1, 2 általános megbetegedésének oka. A hepatitis vírus együttes fertőzése a HIV-1 fertőzéssel gyakoribb, az Egyesült Államokban a HIV-fertőzöttek 10-30% -át teszi ki 3, 4, 5 .

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

Ezt a protokollt a Nebraskai Egyetem Orvosi Központjának Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága (IACUC) hagyta jóvá.

JEGYZET: Állatkísérletek elvégzése előtt szerezze be a helyi IACUC jóváhagyását.

1. A köldökzsinórvér feldolgozása és a shumano HSpC izolálása

2. Humán hepatociták előkészítése transzplantációra

  1. Távolítsa el a mélyhűtött hepatocitákat a folyékony nitrogénből, gyorsan merítse az injekciós üveget a vízfürdőbe, és kb. 90 - 120 másodpercig olvasztsa fel.
  2. Távolítsa el a kupakot az injekciós üvegből, és öntse a megolvasztott hepatocitákat az 50 ml-es kúpos, melegített felolvasztó közegbe.
  3. Szuszpendálja a sejteket úgy, hogy néhány másodpercig kézzel ringatja az 50 ml-es csövet.
    JEGYZET: Ne vortexelje a csövet.
  4. A sejteket 100 x g-nél 8 percig szobahőmérsékleten taszítjuk. Mossuk a pelletált sejteket PBS-ben 0,1% BSA-val, és rázzuk fel friss vagy felolvasztott HSCC-vel (10: 1 arányú) PBS-ben 80 μl/egér végtérfogatban.

3. Állatkezelés, szűrés, genotipizálás és kezelés humán hSPC és hepatocita transzplantáció esetén

4. Az emberi májgraft validálása ELISA-val és az emberi immunrendszer áramlási citometriával

JEGYZET: Az emberi máj és az immunrendszer helyreállítását havonta, a transzplantáció után 1 hónappal kezdve, enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálattal (ELISA) és áramlási citometriával kell értékelni.

5. A TK-NOG egerek HIV-fertőzése és hatása az emberi májra és immunrendszerre

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Reprezentatív eredmények

humanizált

1.ábra : A köldökzsinórvérből származó CD34 + sejtek dúsításának vázlata. (NAK NEK) A zsinór vért limfocita szeparációs táptalajba (LSM) rétegezzük, és a buffy réteg izolálása céljából centrifugáljuk. () Az LS oszlopokat egy mágneses állványra helyezzük és BSA pufferrel öblítjük, majd egy buffy réteg hozzáadásával. A CD34-re pozitív sejteket csapdába ejtjük az oszlopokban, és a CD34-sejteket külön csövekben eluáljuk. Az oszlopgyantákba befogott CD34 + sejteket elvetjük, és a sejteket egy új csőbe gyűjtjük. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.


4. ábra : Az albumin koncentrációt ELISA módszerrel mértük a kettős humán egerek szérumában. Az egereket humán hepatocitákkal (HEP) és CD34 + ős/progenitor hematopoietikus sejtekkel (HSPC) ültetjük át (# 11). A szérumot az átültetés után 1, 4 és 6 hónappal különböző időpontokban gyűjtik össze, és hígításokat végeznek, hogy az ismeretlen mintakoncentrációkat beállítsák a standard tartományban. Minden szimbólum egyedi egérértéket képvisel. Az eredmények a medián mellett az egyéni értékeket is képviselik. * P 8. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.