A kvercetin hatása a vírusos célpontok hepatitis c vírus életciklusára

Tárgyak
Összegzés
Bevezetés
Eredmények
A kvercetin hatása a HCV életciklusára Huh-7,5 sejtekben
A kvercetin hatása a HCV életciklusára az elsődleges humán hepatocitákban
Ha a kvercetin közvetlenül a HCV részecskékre kerül, csökkenti fertőzőképességüket.
A DGAT1, a kvercetin célpontjának lehetséges jelöltje a HCV-fertőzés összefüggésében
A kvercetin hatása a HCV magfehérje LD méretére és szubcelluláris lokalizációjára
Vita
Anyagok és metódusok
Reagensek, antitestek, plazmidok és primerek.
Sejtkultúra
Quercetin citotoxicitási vizsgálat
A HCV termelése, a fertőzés értékelése és elemzése.
Virológiai elemzés
HCV RNS szintek: Replikációs vizsgálatok
RNS izolálás, reverz transzkripció és valós idejű kvantitatív polimeráz láncreakció (RT-PCR)
HCV pszeudorészecskék előállítása
DGAT tevékenységi teszt
Immunfluoreszcencia és olajvörös O festés
Helymeghatározás értékelése
Statisztikai elemzés
további információ
Kiegészítő információk
Word dokumentumok
Kiegészítő információk
Hozzászólások

Tárgyak

Összegzés

A kvercetin egy természetes flavonoid, amelyről kimutatták, hogy tulajdonságai vannak a hepatitis C vírussal (HCV) szemben. Azonban a kvercetin a HCV életciklusát befolyásoló pontos mechanizmusait nem teljesen értjük. Értékeltük a quercetin hatását a HCV életciklusának különböző szakaszaiban HCV-vel fertőzött Huh-7,5 sejtekben és primer humán hepatocitákban (PHH). Mindkét sejttípusban a kvercetin szignifikánsan csökkentette i) a vírusgenom replikációját; ii) fertőző HCV-részecskék termelése és iii) az újonnan termelt vírusrészecskék specifikus fertőzőképessége (85% és 92%, Huh7,5, illetve PHH). Továbbá, közvetlenül a HCV részecskékre alkalmazva a kvercetin 65% -kal csökkentette fertőzőképességét, ami arra utal, hogy befolyásolja a virion integritását. Érdekes módon a kvercetin megakadályozta a HCV által kiváltott diacilglicerin-aciltranszferáz (DGAT) szabályozását és a HCV magfehérje tipikus lokalizációját a lipidcseppek felületén, amelyet a DGAT köztudottan közöl. Összegzésképpen úgy tűnik, hogy a quercetin közvetlen és gazda által közvetített vírusellenes hatásokkal rendelkezik a HCV ellen.

Bevezetés

A hepatitis C vírus (HCV) egy burkolt pozitív szálú RNS vírus, amely az 1 Flaviviridae családba tartozik, 7 fő 2 genotípussal. A betegség spektruma az akut és a krónikus hepatitis, a cirrhosis és a hepatocellularis carcinoma között mozog.

A HCV életciklusa szorosan összefügg a gazdasejt lipid metabolizmusával. A HCV-fertőzést és a lipid-anyagcserét összekapcsoló mechanizmusok a következőket tartalmazzák: 3, 4: (a) a HCV lipiddúsított részecskékként kering, úgynevezett lipoviropartikulák (LVP) 5; (b) az LVP-k azok a HCV-részecskék, amelyek a legnagyobb fertőzőképességgel rendelkeznek, mivel a lipoproteinekhez 6 kapcsolódnak; (c) a lipidfelvételben részt vevő számos receptor, például az alacsony sűrűségű lipoprotein (LDL) receptor, a Niemann-Pick C1-szerű 1 (NPC1L1) 7 és az SR-B1 részt vesz az LVP bejutásában a hepatocitába 8; (d) a HCV összeállítása a lipidcseppek (LD) 9, 10 közvetlen közelében történik; e) a HCV-fertőzés elősegíti az LD felhalmozódását és újraeloszlását a perinukleáris régióban 11; f) diacilglicerin-aciltranszferáz-1 (DGAT1), egy enzim, amely az endoplazmatikus retikulumban szintetizálja a triglicerideket (TG), kölcsönhatásba lép a HCV magfehérjével, és nemcsak új LD képződésében vesz részt, hanem fertőző HCV termelésében is.; (g) A HCV-ről beszámoltak a nagyon kis sűrűségű lipoprotein (VLDL) szekréciós útvonal elválasztásáról a vírusrészecskék szekréciójához 13 .

A közvetlen hatású vírusellenes gyógyszerekkel (DAA) történő kezelés drámai módon megváltoztatta a hepatitis C kimenetelét. Valójában a tartós vírusválasz (SVR) aránya elérte a rekordszintet (> 95%) 14, 15, releváns mellékhatások nélkül. Az ár azonban továbbra is az egyik fő akadály a hepatitis C felszámolásának elérésében, főleg az alacsony és közepes jövedelmű országokban 16 .

Eredmények

A kvercetin hatása a HCV életciklusára Huh-7,5 sejtekben

A kvercetin HCV genom replikációjára gyakorolt hatásának értékeléséhez a Huh-7,5 sejteket megfertőztük a JFH1 törzs sejttenyészete (HCVcc) által termelt HCV-vel, és 50 μM kvercetinnel kezeltük, vagyis olyan koncentrációval, amely nem figyeltek meg toxikus hatást (S1A. ábra, a és b). A kvercetin szignifikánsan csökkentette a negatív szálú HCV RNS intracelluláris mennyiségét, amely a HCV genom replikációjának jellemzője, az oltás utáni 1. napon (61% ± 5,89% gátlás; p = 0,0084) és az oltás utáni 3. napon értékelték (68,38% ± 10%) gátlás; p

A Huh-7.5.1 sejteket 6 órán át JFH1-gyel fertőztük, majd 24 órán át 50 μM kvercetinnel (JFH1 + Q50 μM) vagy DMSO-val kezeltük hordozó kontrollként ( nak nek ) vagy 72 óra ( b, d ). ( a, b ) A sejteket lizáltuk a negatív szálú HCV RNS mennyiségi meghatározásához. ( c, d ) Az extracelluláris HCV RNS szint és a fertőző titer meghatározásához tenyészet felülúszókat gyűjtöttünk. Az eredményeket a vivőanyag-kontroll százalékában fejezzük ki. Az adatokat három független kísérletből kapott átlag ± SD értékek formájában mutatjuk be.

Teljes méretű kép

A kvercetin hatása a HCV életciklusára az elsődleges humán hepatocitákban

A PHH-kat JFH1-gyel (MOI 2,5) 6 órán át fertőztük, majd 24 órán át 50 μM kvercetinnel (JFH1 + Q50 μM) vagy DMSO-val kezeltük hordozó kontrollként ( nak nek ) vagy 72 óra ( időszámításunk előtt ). ( nak nek ) A sejteket lizáltuk a negatív szálú HCV RNS mennyiségi meghatározásához. ( időszámításunk előtt ) A tenyészet felülúszókat összegyűjtöttük a HCV RNS extracelluláris szintjének és a fertőző titer meghatározásához. Az eredményeket a hordozó kontroll százalékában fejezzük ki. Az adatokat két-három független kísérletből kapott átlag ± SD-értékek formájában mutatjuk be.