A méh elektroporációs megközelítései a neuronális alcsoportok ingerlékenységének vizsgálatára és
Összegzés
Ez a kézirat olyan protokollokat tartalmaz, amelyek az utero elektroporációban (SUI) írják le az idegsejtek szerkezeti összekapcsolhatóságát az egyetlen sejt szintjén és a fluoreszcensen jelölt idegsejtek ingerelhetőségét. A szövettan a dendritikus és axonális vetületek jellemzésére szolgál. Az egész sejtek éles szeletekbe történő felvételét használják az ingerlékenység vizsgálatára.
Absztrakt
Az idegrendszer különféle idegsejtek hatalmas skálájából áll. Ezeket az idegsejtek szubpopulációit többek között a különféle dendrites morfológiák, sajátos axonális kapcsolódási mintázataik és szelektív tüzelő válaszaik jellemzik. A fejlődés során a differenciálódás ezen aspektusaiért felelős molekuláris és sejtes mechanizmusok még mindig kevéssé ismertek.
Itt leírjuk a kortikális neuronok strukturális összekapcsolhatóságának és ingerelhetőségének jelölésére és jellemzésére vonatkozó kombinált protokollokat. Az in utero elektroporáció (SUI) protokoll módosítása lehetővé teszi az idegsejtek ritka populációjának jelölését. Ez viszont lehetővé teszi az egyes idegsejtek dendritjeinek és axonjainak azonosítását és monitorozását, az axonális vetületek lamináris helyének pontos jellemzését és morfometriai elemzést. Az SUI alkalmazható vad típusú (WT) vagy genetikailag módosított idegsejtek ingerlékenységében bekövetkező változások vizsgálatára is, az akut szeletek kombinálásával az elektroporált agy teljes sejtjeinek felvételével. Ez a két technika hozzájárul a strukturális és funkcionális összekapcsolódás és az idegsejtek sokféleségét szabályozó molekuláris mechanizmusok jobb megértéséhez a fejlődés során. Ezek a fejlődési folyamatok fontos következményekkel járnak az axonhuzalozás, az idegsejtek funkcionális sokfélesége és a kognitív rendellenességek biológiája szempontjából.
Bevezetés
A dendritikus és axonális struktúrák kialakulása az idegrendszer áramkörének szabályozásának fontos aspektusa, ideértve az agykérget is. Kritikus szerepet játszik a különféle idegi alcsoportok szelektív bekötése során. Több friss jelentés kimutatta, hogy az összekapcsolhatóság mellett az idegsejtek molekuláris sokféleségét tükrözi a nagyon specifikus tüzelési módok megszerzése is. Azok a mechanizmusok azonban, amelyek a fejlődés során meghatározzák a különböző idegsejt-altípusok ingerelhetőségét és összekapcsolhatóságát, valamint azok koordinációjának mértékét, még mindig rosszul vannak megértve.
Bár ez a protokoll leírja az egerek elektroporációját az embrionális napon (E) 15.5, ez a technika bármely életkorban elvégezhető E9,5 és 3 nap között a posztnatális (P) 2 4. Míg az elektroporáció korai szakaszában az idegsejteket és a a kéreg talamusza és mély rétege, egy fejlettebb szakaszú elektroporáció a felszínesebb rétegeket jelöli (pl. E15.5 IUE II-III. réteg neuronok). Összefoglalva, az SUI kombinációja az egysejtes morfológiai elemzéssel és az elektrofiziológiával hasznos eszköz az idegrendszeri idegsejtek hatalmas szerkezeti és funkcionális sokféleségének hátterében álló molekuláris mechanizmusok tisztázására.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Jegyzőkönyv
Valamennyi állatkísérletet a Madridi Közösség Állatgondozási és Foglalkoztatási Bizottsága hagyta jóvá, a nemzeti és európai jogszabályoknak megfelelően (PROEX 118/14; PROEX 331/15). Tartsa fenn a steril körülményeket az eljárás során.
1. Elektroporáció a méhben
MEGJEGYZÉS: Ez az SUI protokoll más, korábban korábban közzétett 5, 6, 7 adaptáció. Ez a kézirat az E15.5 embriók SUI protokollját írja le, a riporter stratégiájának módosításával, amely lehetővé teszi 8 egyén morfológiájának tanulmányozását. neuronok és elektrofiziológiai tulajdonságaik külön kísérletben standard GFP riporter plazmidok felhasználásával.
2. Felkészülés a műtétre
- Végezzen túlélési műtét aszeptikus eljárásokkal. Garantálja a steril állapotokat, például maszkokat, kesztyűket, műszereket és műtéti területet. Sterilizálja a sebészeti eszközöket (szike, Adson csipesz, edzett finom olló, ívelt olló, Dumont csipesz és tűtartó).
- Válasszon 1/0,58 mm OD boroszilikát üveg kapillárisokat. hajlékony kapillárisok 3. Tájolás az optimális 1 cm hosszúságú húzás után. Vágja le a tű hegyét 30 ° -os szögben finom csipesszel (1B. Ábra).
- Készítsen 500 ml steril izotóniás oldatot (1x PBS vagy Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)). Adjunk hozzá penicillin-sztreptomicint 1: 100 arányban, és melegítsük ezt az oldatot 37 ° C-ra. A műtét után 4 ° C-on tárolható.
- Szubkután injektáljon egy preoperatív fájdalomcsillapító adagot (például karprofen, 5 mg/testtömeg-kg).
- Az állatokat melegen tartják a műtéthez, fűtőbetétre helyezve. A tiszta ketrecet 37 ° C-ra melegítjük a posztoperatív helyreállítás során.
- Vemhes C57BL/6 E15.5 egeret izofluránnal altasson el. Először infundáljon egy zárt kamrát 3% izofluránnal, 0,8 l/perc oxigénnel, és hagyja az egeret alvásig bent. Helyezze az egeret meleg borogatásra, és helyezze az orrát és a száját egy izoflurán-maszkba. A műtét során fokozatosan csökkentse az érzéstelenítést 1,5% izofluránra a maszkon keresztül. Erősítse meg a megfelelő érzéstelenítést a pedál reflexjének elvesztésével (a lábujj csípése). Az optimális eljárás körülbelül 20 percet, de legfeljebb 45 percet vesz igénybe.
- Kenjen be szemkenőcsöt, hogy megakadályozza a szem kiszáradását az eljárás során.
- Távolítsa el a szőrt a
3 cm-re a hastól (elektromos borotva vagy szőrtelenítő krém használatával). Mossa le a műtéti területet 70% -ban etanollal impregnált pamut törlőkendővel, majd jóddal infúzióval ellátott pamut törlőkendővel. Ismételje meg háromszor.