A neurális címer elődsejtjeinek etető nélküli levezetése az emberi pluripotens őssejtek protokolljából

Összegzés

Absztrakt

Bevezetés

Az ideggerinc (NC) sejtjei gerinces neuruláció során jelennek meg az epidermisz és az ideghám között. Szaporodnak és széles körben vándorolnak a fejlődő embrióban, és lenyűgöző sokféle utódsejt-típust hoznak létre, beleértve a csontot/porcot, a koponya-arc vázat, az érzékszervi idegeket, a Schwann-sejteket, a melanocitákat, a simaizomsejteket, az enterális idegsejteket, az autonóm idegsejteket, a kromaffinsejteket, szív septum sejtjei, fogai és mellékvese/pajzsmirigy sejtjei 6. Ezért az NC sejtek vonzó sejttípust jelentenek az őssejtmező számára, és fontosak különféle betegségek, például a Hirschsprung-kór 7, a családi dysautonomia 8, mint pl. valamint rákos megbetegedések, például a neuroblastoma 9. Ezenkívül lehetőséget kínálnak az emberi embrionális fejlődés in vitro tanulmányozására.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

1. Tenyésztő táptalaj, bevont lemezek előkészítése és hPSC-k karbantartása

Előkészítés 1.1 Táptalaj

Megjegyzés: az összes szűrőközeget sterilizálásra, és legfeljebb 2 hétig 4 ° C-on, sötétben tárolják. A vállalat és a katalógus reagensneveinek száma a Anyagtáblázat.

  1. DMEM/10% FBS: Keverjen össze 885 ml DMEM-et, 100 ml FBS-t, 10 ml penicillint/sztreptomicint és 5 ml L-glutamint.
  2. HES-táptalaj: Keverjen össze 800 ml DMEM/F12, 200 ml KSR, 5 ml L-glutamin, 5 ml penicillin/sztreptomicin, 10 ml minimális MEM esszenciális aminosavoldat, 1 ml β-merkaptoetanol. A táptalaj szűrése után adjunk hozzá 10 ng/ml FGF-2-t.
    VIGYÁZAT: A β-merkaptoetanol mérgező, kerülje az inhalációt, a lenyelést és a bőrrel való érintkezést.
  3. KSR-differenciáló táptalaj: Kombináljon 820 ml Knockout DMEM-et, 150 ml KSR-t, 10 ml L-glutamint, 10 ml penicillin/sztreptomicint, 10 ml MEM minimális esszenciális aminosavoldatot és 1 ml β-merkaptoetanolt.
  4. N2-differenciáló közeg: Oldjunk fel 12 g port 980 ml DMEM/F12 dH20-ban, adjunk hozzá 1,55 g glükózt, 2 g nátrium-hidrogén-karbonátot és 100 mg APO humán transzferrint. Keverjünk össze 2 ml dH2O-t 25 mg humán inzulinnal és 40 µl 1 N NaOH-val, és adjuk hozzá az oldott oldatot a táptalajhoz. Adjunk hozzá 100 liter putreszine-dihidrokloridot, 60 l szelenit, 100 l progeszteront, és a térfogatot dH 2 O-val 1 literre emeljük.

1.2 A tenyészlemezek bevonata

1.3 A hPSC-k karbantartása

Megjegyzés: A hPSC-ket 0,1% zselatinban és mitotikusan inaktivált egér embrionális fibroblasztokban (MEFS) tartjuk HES-táptalajban, kiegészítve 10 ng/ml FGF-2-vel, amint azt korábban leírtuk 10,12. A sejteknek 6-8 naponként meg kell osztódniuk.

  1. Vegyen be egy 10 cm-es edényt szobahőmérsékleten 5 percig 8 ml 0,1% zselatinnal (1x PBS-ben magnézium vagy kalcium nélkül).
  2. Kiolvasztjuk a gyorsfagyasztott MEF-eket 37 ° C-os vízfürdőben, és adjunk hozzá 1 millió MEF-t 10 ml DMEM/10% FBS-hez.
  3. Szívja le a zselatint és lemezezze le a sejteket. Inkubáljuk 37 ° C-on legalább 6 órán át.
  4. Az előkészített MEF lemezről szívja le a DMEM/10% FBS-t, mossa le a lemezt egyszer 1x PBS-sel, és adjon hozzá 10 ml HES-táptalajt, kiegészítve 10 mM Y-27632 dihidrokloriddal. Hagyja a közeget 20 percig 37 ° C-ra melegedni.
    Megjegyzés: A hPSC-k kézi felosztásához beépített mikroszkóppal ellátott lamináris áramlású burkolatot használnak. A sejteket azonban megfelelő alternatív módszerekkel passzálhatjuk.
  5. Beépített mikroszkóppal ellátott lamináris áramlású motorháztető alatt különálló telepeket különítsen el egy mobil daru segítségével, és hagyja lebegni.
  6. 1 ml-es fecskendővel szívja fel az úszó telepeket, és küldje őket a hűvös, meleg MEF lemezre. Vigye a sejtek mintegy negyedét az új edénybe. Inkubáljuk 37 ° C-on.
  7. Táplálja a sejteket naponta friss HES táptalajjal.