AZ 1,3-PROPANODIOL-OXIDOR-REDUKTÁZ ENZIM-REDUKTÁZ ELVÁLASZTÁSA ÉS BIOKÉMIAI JELLEMZÉSE
Elválasztás és biokémiai jellemzése Az enzim 1,3- PROPANODIOL OXIDORREDUCTASE érkező NATIVE törzset Clostridium spp IBUN 158 NIXYOLLY ALEXANDRA CUCAITA Vasquez Ipari Microbiologist PUJ Code 186286 MICROBIOLOGY Egyetemi Intézet posztgraduális tézis, hogy optimalizálja UNACULTÍA MICROBIROBIOLOGÍA UNIVERSOGRADO EGYETEM MICROBIA GRADUATE DOKTORI UNACULTURAL BIOLÓGIAI INTÉZET. COLOMBIA-tól BOGOTÁ DC, COLOMBIA 2010
Az 1,3-PROPANODIOL-OXIDORREDUKTÁZ-ENZIM KIVÁLASZTÁSA ÉS BIOKÉMIAI JELLEMZÉSE A Clostridium spp IBUN 158 NIXYOLLY ALEXANDRA CUCAITA VÁSQUEZ Ipari Mikrobiológus P.U.J. Code 186286 igazgató, DOLL. A bioprocesszorok és a bioprospektáló csoport szolventogén mikroorganizmusok egyetemi docense A BIOTECHNOLÓGIA MIKROBIOLÓGIAI INTÉZMÉNYEK Posztgraduális Interfakulációi Kolumbiai Nemzetközi Egyetem BOGOTÁ D.C, Kolumbia 2010
Neked, anya, minden hálám és örök szeretetem, amiért támogattál és mindig velem voltam. Lányomnak a türelméért és szeretetéért, a nővéremért, aki feltétel nélküli barátom, Diegónak és az egész családomnak, hogy támogatják ezt az álmot, amely ma valóság.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Dr. Dolly Montoya Castaño, aki ezt a munkát irányította, hogy lehetőséget biztosított számomra, hogy együtt dolgozhassak vele és egy olyan kutatócsoporttal, amely a tudásnál többet adott az életemhez. Csoporttagjaimnak: Julieth Serrano, Ximena Pérez, Natalia Comba, Mauricio Bernal, Herlinda Amaris, María Angélica Peña, Yenny Rocio Martínez, Carlos Barragán, Gernot Gruss, Andres Gutierrez és mindazok, akik valahogy a mikrobiológiai laboratórium részesei. A mikrobiológia posztgraduális interfakultúrájának, különösen Socorro Prieto támogatásáért és együttműködéséért. Jhon Floreznek, amiért nekem olyan volt, mint egy angyal, az együttműködéséért és a türelméért, köszönöm szépen. Ana Lucia Castiblancónak és Jorge Cortazarnak készségükért és segítségükért. Mesteri fokozatú barátaimnak, különösen Viviannek, Merynek, Carolinának, Osquitarnak és Alexisnek, hogy ilyen jó barátok voltak, támogattak és mindig ott voltam, hogy jó tanácsokat adjak nekem. Kolumbiai Nemzeti Egyetemnek, amiért lehetővé tette a kutatás befejezését és befejezését.
TARTALOMJEGYZÉK ÖSSZEFOGLALÓ 1. BEVEZETÉS 1 2. ELMÉLETI KERET 3 2.1. A biodízel előállítása 3 2.2. 1,3-propándiol 4 2.3. 1,3-propándiol szintézise 5 2.4. A Clostridium sp. Nemzetség mikroorganizmusai 7 2.5. Az 1,3-propándiol képződésének élettana Clostridium sp. 7 2.6. Dehidrogenáz enzimek 9 2.6.1. Az enzimaktivitás kísérleti mérése 11 2.6.2. Az 1,3-propándiol-dehidrogenáz enzimatikus aktivitásának in situ kimutatása 11 2.6.3. Enzimek megszerzése 12 2.6.4. Enzimtisztítás 13 2.6.5. A teljes fehérjekoncentráció meghatározása 14 2.6.6. Enzimatikus jellemzés 14 2.7. Az IBUN szolventogén vonal bioprocesszorainak és bioprospektáló csoportjának előrehaladása 16 3. ÁLTALÁNOS CÉL 18 Konkrét célok 18 4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 19 4.1. Mikroorganizmusok, táptalaj és tenyésztési körülmények 19 4.2. Növekedési kinetika 20 4.3. A nyers fehérjekivonat megszerzése
4.3.1. Nyersfehérje-kivonat előállítása 20 4.3.2. Fehérjék meghatározása fluorometriai módszerrel 20 4.3.3. Az enzimaktivitás meghatározása 21 4.4. 1,3-propándiol-dehidrogenáz enzim tisztítása 22 4.4.1. Fehérje kicsapódás 22 4.4.2. Az enzim szétválasztása és tisztítása 22 4.4.3. A tisztítás ellenőrzése 22 4.4.4. Fehérjeelemzés (PAGE) 23 4.5. Az 1,3-propándiol-dehidrogenáz enzim jellemzése 23 4.5.1. Az optimális hőmérséklet meghatározása 23 4.5.2. Az optimális pH 23 meghatározása 4.5.3. A Km és Vmax kinetikai paraméterek meghatározása 24 4.5.4. A kétértékű ionok hatása 24 4.5.5. Előzetes teszt a molekulatömeg meghatározására 24 4.5.6. Az izoelektromos pont meghatározása 25 5. EREDMÉNYEK 26 5.1. A nyers fehérjekivonat megszerzésének módszere 26 5.1.1. Munkafeszítések 26 5.1.2. Növekedési kinetika 26 5.2. A nyers fehérjekivonat megszerzése 27 5.2.1. Nyersfehérje-kivonat előállítása 27 5.2.2. Enzimaktivitás 28 5.2.3. NAD + H kalibrációs görbéje 29 5.3. Az 1,3-propándiol-dehidrogenáz enzim szétválasztása és tisztítása 29 5.3.1. Fehérje csapadék 30
5.3.2. Elválasztás és tisztítás 31 5.3.3. Fehérjeelemzés (PAGE) 35 5.4. Az 1,3-propándiol-dehidrogenáz enzim jellemzése 36 5.4.1. A hőmérséklet hatása az enzim aktivitására 36 5.4.2. Az optimális pH 37 meghatározása 5.4.3. A Km és Vmax kinetikai paraméterek meghatározása 37 5.4.4. A kétértékű ionok hatása az enzim aktivitására 38 5.4.5. Előzetes teszt a molekulatömeg meghatározására 39 5.4.6. Az enzim izoelektromos pontjának meghatározása 40 6. MEGBESZÉLÉS 41 7. KÖVETKEZTETÉSEK 51 8. AJÁNLÁSOK 52 9. BIBLIOGRÁFIAI HIVATKOZÁSOK 53 10. MELLÉKLETEK 61 10.1. MELLÉKLET 1. NAD + H standard görbe 61 10.2. 2. MELLÉKLET Az enzimaktivitás meghatározása 63 10.3. 3. MELLÉKLET A Clostridium IBUN 158B növekedési görbéje RCM táptalajban (oxoid) 64 10.4. 4. MELLÉKLET A Clostridium IBUN 158 B növekedési görbéje TGY 65 táptalajban 10.5. 5. MELLÉKLET Clostridium IBUN 158B száraz tömege és abszorpciós görbéje (600 nm) TGY 67 táptalajban 10.6. 6. MELLÉKLET Standard görbe az 1,3-propándiol-dehidrogenáz molekulatömegének meghatározására poliakrilamid-gélben denaturáló körülmények között 68
1,3-propándiol-dehidrogenáz 39 19. ábra: Az 1,3-propándiol-dehidrogenáz enzim aktivitásának százalékos aránya a klorid-sók hatására 39 20. ábra Az 1,3-propándiol-dehidrogenáz enzim molekulatömegének becslése 10% poliakrilamidban gélek denaturáló körülmények között 40 21. ábra. NAD + H görbe és a Bio-Rad 61 spektrofotométer vonalának egyenlete 22. ábra: NAD + H görbe és a vonal egyenlete a TECAN ELISA leolvasóban 62 23. ábra A szükséges idő kinetikája nagyobb enzimatikus aktivitás eléréséhez 63 24. ábra: Clostridium IBUN 158B növekedési görbéje RCM 64 táptalajban 25. ábra: Clostridium IBUN 158B növekedési görbéje TGY 66 táptalajban 26. ábra: Clostridium IBUN 158B száraz tömeg görbéje Vs Abs 600 nm TGY 67-ben táptalaj 27. ábra. A Coomassie Blue 68-mal festett 1,3-propándiol-dehidrogenáz enzim tömegének becsléséhez használt standard molekulatömeg görbe. Mar az 1,3-propándiol-dehidrogenáz enzim tömegét a 68-as Zymogram-ból