AZ AKVAKULTURÁLIS KIADÁSOK ÉS ÉTKEZÉSEK MINŐSÉGI ELLENŐRZÉSE

Mellette:
Juan Carlos Medina B.
Eliezer Castillo

Bevezetés

A mikotoxinok olyan másodlagos, kis molekulatömegű metabolitok, amelyeket gombák termelnek, kóros hatásokat okoznak emberekben és állatokban.

14.2. Az immunokémiai módszerek fejlesztése

Mivel a mikotoxinok nem antigének, az első tanulmányok olyan fehérjékkel vagy polipeptidekkel való konjugáció megvalósítását jelentették, amelyek transzporterként szolgálhatnak az optimális körülmények között az ellenanyagok termeléséhez nyulakban és más állatokban. A technika fejlődésével a különféle mikotoxinok ellen monoklonális antitesteket állítottak elő. Ez a fejlődés az elmúlt 8 évben nőtt. A 14.1. a rendelkezésre álló mikotoxin antitestek jelenlegi arányát mutatjuk be.

Mint várható volt, különböző típusú immunvizsgálatokat fejlesztettek ki, amelyek közül kiemelkednek az ELISA (enzimhez kapcsolt immunvizsgálatok), az RIA (radioimmunassay) és az immunoaffinitás oszlopok. E módszerek többsége nagyon érzékeny, specifikus és könnyen kezelhető. Amellyel dimenzió alakult ki a mikotoxin elemzés módszertanát illetően.

Mielőtt folytatnánk a különböző típusú immunvizsgálatok megvitatását, meg kell vizsgálnunk a következőket:

Mivel a legtöbb immunvizsgálat az antitestmolekulák kötődési helyeiért folytatott versengésen alapul a mintában jelen lévő toxinok és a rendszerre jellemző markáns toxinok, konjugált mikotoxinok között. Ezért a vizsgálati rendszerben a specifikus antitest mellett tökéletesen jelölt mikotoxinnal kell rendelkezni.

Szükséges egy jó módszer a mikotoxinok extrahálására és megfelelő eljárás a kötött és szabad toxinok elválasztására.

Az analóg vegyületekkel szembeni antitestek térhálósodásának mértékét ismerni kell.

Mivel mindig fennáll annak a lehetősége, hogy a minta egyes alkotóelemei reagálnak az antitestekkel, a megfelelő tesztek elvégzése előtt részletesen meg kell vizsgálni az egyes mátrix típusokat.

Az extrakt tisztítási eljárásokat a legtöbb immunvizsgálati rendszerben nem kell elvégezni. Olyan módon, hogy a szilárd mátrixból származó kivonat közvetlenül felhasználható legyen a vizsgálatban, miután a rendszerre jellemző pufferoldattal hígítottuk. A meghatározások érzékenysége azonban növekszik, ha a kivonatok tisztítására megfelelő eljárást alkalmaznak.

14.1. Táblázat Mikotoxinok elleni antitestek A mikotoxinok T-típusa

Aflatoxinok: B1, B2, G1	Saját P
Aflatoxin metabolitok B2a, Q1, M1, Ro	Saját P
Ciklopiazonsav	P
Ergotamine	P
Fuzarokromanon	P
Fumonizin	M
Kojic sav	P
Ochratoxin A	Saját P
PR toxin	P
Rubratoxin B	P
Szekalonsav	P
Sterigmatocystin	P
Trichotecének: DAS, DON, FX, DOVE, NIV, T-2 és metabolitjaik	Saját P
Zearalenon	Saját P
Patulin	P

Forrás: Chu, 1992.

14.2.1 Radioimmun tesztek (RIA)

A radioimmun vizsgálati eljárás magában foglalja egy specifikus antitest inkubálását egy minta oldatával vagy ismert koncentrációjú standard oldattal és állandó mennyiségű jelzett toxinnal. A szabad és megkötött toxinok elválasztása után a radioaktivitást meghatározzuk ezen frakciók mindegyikében.

A mintában lévő toxin koncentrációját úgy határozzuk meg, hogy összehasonlítjuk azt egy standard görbével, amelyet úgy határozunk meg, hogy a kötött frakció és a szabad frakció radioaktivitásának arányát ábrázoljuk a jelöletlen toxinok koncentrációjának logaritmusával szemben.

Az ilyen típusú mikotoxinok érzékenységét a 14.2. Táblázat foglalja össze. De általában ez az immunvizsgálat 0,25–0,5 ng tisztított toxint képes kimutatni. Élelmiszerminták esetében a kimutatási határok 2–5 ppb. Ez az érzékenység javítható a kivonatok tisztításának bizonyos eljárásaival, vagy nagy aktivitású radioaktív markerek, például 125 I-vel jelölt mikotoxinok alkalmazásával. Bár ez a technika pontos eredményeket nyújtó eszköz, a módszer magában foglalja a radioaktivitás alkalmazását, amely ezért kizárólag kutató laboratóriumokban és egyes ipari létesítményekben használják.

14.2. Táblázat ELISA rendszerek érzékenysége mikotoxin vizsgálatokhoz A mikotoxinok alkalmazásának kimutatási határai (μg/kg)

AFB/AF	Kukorica, búza, földimogyoró	1 - 10
Aflatoxin M	Tej	0,01
Deoxinivalenol	Kukorica, búza	300
Ochratoxin A	Kukorica, búza	5.
Toxin T - 2	Kukorica, búza	2,5 - 50
Zearalenon	Kukorica	100

Forrás: Chu, 1992

14.2.2. Enzimhez kapcsolt kompetitív immunvizsgálatok (ELISA)

Általában az ELISA rendszer körülbelül 10-100-szor érzékenyebb, mint a tisztított mikotoxinok radioimmun-vizsgálata. Képes kimutatni olyan alacsony értékeket, mint 2,5 pg tiszta mikotoxin.

Ezen ELISA rendszerek jelenlegi fejlesztése lehetővé teszi az aflatoxin, T-2 toxin vagy dezoxinivalenol meghatározását kevesebb mint egy órán belül az extrakciós folyamat után. Az ELISA rendszer érzékenysége javul, ha kivonat tisztítási eljárásokat hajtanak végre. Az ELISA rendszerek érzékenysége minden mikotoxinra specifikus, 14.2. Táblázat. kapcsolatot mutat be ezen információkkal kapcsolatban.

Az indirekt ELISA-vizsgálat során egy fehérjéhez vagy polipeptidhez kötött mikotoxin által alkotott konjugátumot immobilizálunk egy mikrotiterlemezre. A lemezt a specifikus antitesttel inkubáljuk homológ mikotoxinok jelenlétében és távollétében. A lemezen immobilizált fehérjekonjugátumhoz kötött antitest mennyiségét ezután meghatározzuk egy kereskedelemben kapható IgG enzim komplextel történő reakcióval, majd a szubsztráttal történő későbbi reakcióval. Így a mintákban lévő toxin és a szilárd fázisban lévő toxin ugyanazon kötőhelyekért verseng az oldatban lévő specifikus antitesttel.

---