Több kapszula stabilizációs kölcsönhatás magas struktúrában

Tárgyak

Összegzés

A rosszul vizsgált pikornavírus, a humán parechovírus 3 (HPeV3) újszülöttek szepszisét okozza rendelkezésre álló terápiák nélkül. A HPeV3 4,3 Å felbontási struktúrája önmagában és 15 Å felbontással humán monoklonális antitest Fab komplexekben mutatja be a picornavírus kapszid várható szerkezetét, három különálló tulajdonsággal. Először is, a HPeV3 RNS genomjának 60% -a 60 helyen erősen rendezett, amit az aszimmetrikus rekonstrukció megerősít, és kölcsönhatásba lép a VP1 és VP3 kapszid fehérjék konzervált régióival. Másodszor, a VP0 N kifejezés stabilizálja a kapszid belső felületét, ellentétben más pikornavírusokkal, amelyeknél az ejekciónál, mint a VP4, RNS transzlokációs csatornát képez. Végül a VP1 hidrofób zsebe, az antipicornavirális gyógyszer, a plekonaril kötőhelye blokkolva van, és így alkalmatlan az antivirális fejlődésre. Ezek az eredmények együttesen irányt mutatnak a semlegesítő antitestek, az RNS-fehérje kölcsönhatásokon alapuló vírusellenes gyógyszerek és az RNS nukleáción alapuló vírus-összeállítás boncolásához.

Bevezetés

A Picornaviridae egy kicsi, pozitív érzékű, ikozaéderes szimuláció, egyszálú RNS vírusok családja. A parechovírus az a faj, amely 16 genotípussal rendelkezik ezen a családon belül, és főleg az emberek, különösen a gyermekek enyhe fertőzésével társul. Azonban egy kialakuló kórokozó, a humán parechovírus 3 (HPeV3) súlyos fertőzéseket okozhat a központi idegrendszerben, például az agyhártyagyulladást 1, és az újszülöttek szepszisének 2 vezető oka. A HPeV-fertőzés leküzdésére nincsenek vírusellenes szerek vagy oltóanyagok. Sok más pikornavírustól eltérően a HPeV-k mind struktúrájuk, mind funkciójuk szempontjából gyengén jellemezhetők, a HPeV1 kivételével, ahol a 3 receptor ismert. A HPeV3 által a HPeV3 által mutatott nagy különbségek a tropizmusban a többi HPeV-hez képest elengedhetetlenné teszik a HPeV3 szerkezeti tulajdonságainak vizsgálatát annak patogenezisének és lehetséges receptorkötésének jobb megértése érdekében.

Krioelektron mikroszkóppal és képrekonstrukcióval elemezzük a HPeV3 szerkezetét önmagában és humán Fab monoklonális antitesttel komplexben. A virion szerkezete azt mutatja, hogy a VP1 zsebkötő gyógyszerek, mint pl. A pleconaryl, valószínűleg nem kötődnek a HPeV-hez; hogy a VP0 fontos fehérje a kapszid belső felületének stabilizálásához, és végül, hogy a HPeV-összeállítást valószínűleg a genom és a kapszid többszöri interakciója vezérli, a VP1-ben és a VP3-ban konzervált aminosavak, valamint az RNS-ben lévő szár- és hurokszerkezetek révén. Elkülönítjük és jellemezzük a HPeV3-ra specifikus humán monoklonális antitestet, amely nagyon hasznos lehet a vírusok diagnosztizálásának elősegítésében és a vírus-gazda kölcsönhatások tanulmányozásában.

Eredmények és vita

A HPeV3 szerkezete

Teljes méretű kép

A HPeV3 RNS rendezett szerkezete

Teljes méretű kép

Hidrofób VP1 zseb

A vírusellenes gyógyszer, a plekonaril és származékai általában blokkolják az enterovírus fertőzéseket, például az EV-D68 (4. hivatkozás). Ezek a gyógyszerek kiűzik a VP1 β-hordó hidrofób zsebében található lipidet ("zsebfaktor"), és a 4-es kapszid stabilizálásával blokkolják az RNS-bevonatot. A HPeV3 VP1 hidrofób zsebébe vezető csatornát három nagy konzervált Y133, F163 és Y164 oldallánc blokkolja (1f és 3. ábra) az EV-D68-hoz képest (4. hivatkozás). Ezért megmagyarázhatjuk azokat a megfigyeléseket, amelyek szerint a pleconaril nem működik a 2. klinikán, és megjósolhatjuk, hogy az ilyen zsebfaktor-utánzatok nem fognak működni az egyik eddig szekvenált HPeV ellen.

HPeV3 - Fab komplex szerkezet

Elkülönítettünk egy HPeV3-specifikus humán monoklonális antitestet, az AT12-015-öt, amely az 152037, A308/99 HPeV3 izolátumokhoz és két fertőzött sejtben lévő klinikai izolátumhoz kötött. Nem semlegesítette az 152037-et egy Vero sejtvonalon alapuló vizsgálatban. Az 152037 HPeV3 izolátum szerkezetét a Fab AT12-015 komplexben oldottuk meg (1. kiegészítő táblázat; 4a. Ábra; 1. kiegészítő ábra). A Fab-molekulák felismernek egy konformációs epitópot a kanyon peremén (4a. Ábra). A hozzájárulások mind a VP3-ból (hZβB, βChA, βEβF és βGβH hurkok), mind pedig a VP1-ből (βBβC, βCβD és βEβF, C) származnak, főként a HPeV3-ban konzerválva, ami megmagyarázza az antitest specifitását erre a genotípusra (3. ábra). . A Fab ujjlenyomat átíveli a VP1 C terminust, ahol sok más HPeV tartalmaz RGD motívumot az integrin receptoraikhoz való kötődéshez (3. és 4b. Ábra) 3. Mivel az AT12-015 specifikus a HPeV3-ra és nem kötődött a többi vizsgált HPeV-genotípushoz, nagyon hasznos lehet a vírusdiagnosztika elősegítésében és a vírus-gazda kölcsönhatások tanulmányozásában. A semlegesítő páciensszérumok epitópjaival történő további összehasonlítás segíthet megérteni a betegek semlegesítési mechanizmusát 13 .

( nak nek ) A HPeV3-Fab AT12-015 komplex sugárirányú színfelületi ábrázolása 15 Å felbontás mellett, 1,5σ-val az átlagos küszöb felett. A Fab-molekulák (vörös) a kanyon régió körül kötődnek. ( ) HPeV3 ütemterv. A Fab lábnyom (piros körvonal) a VP3-ra (zöld) és a VP1-re (piros) illeszkedik.

Teljes méretű kép

Összességében ez a munka több stabilizáló RNS-kapszid kölcsönhatást mutat a parechovírus gyógyszerek új célpontjaként. Feltárjuk ezen kapszulák szokatlan stabilitását intra-pentamer szinten VP3 kölcsönhatások és az inter-pentamer VP0 kölcsönhatások révén, és javasoljuk, hogy a HPeV genom bevonó mechanizmusa jelentősen eltérjen a többi pikornavírustól.

Mód

Vírustisztítás és inaktiválás.

A HPeV1-Harrist és a HPeV2-2008-at a Holland Nemzeti Egészségügyi és Környezetvédelmi Intézet, Bilthoven, Hollandia biztosította. A HPeV4-251176, a HPeV5-552322, a HPeV6-550389 és két HPeV3 klinikai izolátumot az Amszterdami Akadémiai Orvosi Központ Klinikai Virológiai Laboratóriumából kaptuk. A vírusállományokhoz a HPeV1, HPeV2, HPeV3 A308/99 (Hiroyuki Shimizu és Miyabe Ito ajándék típusa) és a HPeV4-6 sejteket HT29 sejtvonalban tenyésztettük Eagle minimális esszenciális táptalajában, L-glutaminsavval (0, 2 ×), nem esszenciális aminosavak (1x), sztreptomicin (0,1 μg ml -1), penicillin (0,1 μg ml -1) és 2% hő-inaktivált FBS (a HT29 sejteket 8% FBS hővel inaktivált táptalajban tartottuk). Ezeket a törzseket alkalmaztuk az AT12-015 antitest kötési és semlegesítési vizsgálatokban.