A glükozidáz ii β-alegysége, amely a kaszpáz-3-szerű aktivitás új szubsztrátja
Tárgyak
Összegzés
Bevezetés
Eredmények
A Gas2/HSP90/HSP40 kaszpáz-3 rokon fehérjekomplexet képzett a rizsszuszpenziós sejtekben hőterhelés alatt
( nak nek ) A G-75 oszlopból származó aktív kaszpáz-3 frakciókat egyesítettük és tovább tisztítottuk egy Mono-Q oszlopon, amelyet 20 mM Tris/HCl pufferrel (pH 8,0) egyensúlyoztunk ki. A fehérjéket NaCl gradienssel eluáltuk (0
1 M) 20 mM Tris/HCl pufferben, pH 8,0, 1 ml/perc áramlási sebességgel. A fehérjéket abszorbanciával detektáltuk 280 nm-en. A csúcsokat összegyűjtöttük. ( ) A Mono-Q oszlopból összegyűjtött azonos számú csúcsokat Ac-DEVD-AMC-vel inkubáltuk. Az AMC fluoreszcenciát mikrolemez-olvasóval mértük 30 ° C-on. Az RFU/óra a relatív fluoreszcencia egységnyi különbségeket képviselte, amelyek 1 óra alatt keletkeztek. Az I és II a kaszpáz-3-szerű aktivitást mutató csúcsokat jelöli.
Teljes méretű kép
Teljes méretű asztal
A Gas2 expressziós profilja különböző feszültségek mellett.
Fiziológiai körülmények között a Gas2 a glükozidáz II nem katalitikus alegysége, amely részt vesz a fehérjék glikozilezésében az ER-ben. A Gas2 abiotikus stressz alatti biológiai funkcióinak azonosítása érdekében a Gas2 expresszióját valós idejű kvantitatív polimeráz láncreakcióval mértük különböző körülmények között, még DTT által kiváltott ER stressz alatt is. A 6,4 mM DTT-vel történő kezelés az UPR marker génje, az Os bZIP50 34 expresszióját indukálta, ami azt jelezte, hogy a DTT képes ER stresszt indukálni a rizsszuszpenzió sejtjeiben (2a. Ábra), és ilyen körülmények között a Gas2 szabályozva volt ( 2b. Ábra). Az ER stressz mellett a Gas2 szintjét különböző abiotikus stresszek, például hideg stressz (2c. Ábra), ozmotikus (2d. Ábra) és só (2e. Ábra) alatt is szabályozták.
( nak nek ) A DTT vad típusú és OsGas2 RNSi sejtvonalakban indukálta az OsbZIP50 expresszióját. Protoplasztokat állítottunk elő szuszpenzióban lévő sejtekből, és 6,4 mM DTT-vel kezeltük 18 órán át 26-28 ° C-on ( ) OsGAS2 expresszió szuszpenziós sejtproplasztokban, 6,4 mM DTT kezeléssel, különböző időpontokban. ( c - e ) Az OsGAS2 kifejeződése 8 napos palánták gyökerében 4 ° C-os kezeléssel ( c ), 150 mM NaCl ( d ) és a PEG 6000 40% -át ( és ) különböző időkben. Az RT-PCR-hez teljes RNS-t izoláltunk, és a kísérleteket háromszor megismételtük.
Teljes méretű kép
Szubcelluláris hely
Mivel a Gas2 kaszpáz-3 rokon fehérje komplexet képez a TPR-t tartalmazó GRP94-szel és HSP40-gyel, megvizsgáltuk e három fehérje szubcelluláris lokalizációját. A várakozásoknak megfelelően a Gas2 és a GRP94 az ER-ben (3a. Ábra, b), míg a TPR-t tartalmazó HSP40 a citoplazmában volt elhelyezve (3c. Ábra). Mivel a kaszpáz-3-szerű aktivitás jelen volt a citoplazmában, ez arra utal, hogy specifikus stressz körülmények között a TPR-tartalmú HSP40 komplexet képezhet a Gas2-vel és a GRP94-gyel az ER-citoplazma határfelületén, mivel ismert, hogy az ER kötési helyeket biztosít sok citoszol fehérje.
A 35S: Grp94-GFP, 35S: GAS2-GFP és 35S: GFA2-GFP termékeket PEG-kalcium által közvetített transzformációval a rizspalánták szárából protoplasztokba juttattuk. A GFP fluoreszcenciáját 16 órás inkubálás után figyeltük meg PerkinElmer UltraVIEW VoX konfokális mikroszkóppal. ER-Tracker ™ kék-fehér DPX-t (E12353) használtunk ER lokalizációs kontrollként. A kísérleteket legalább ötször megismételtük. Bar = 5 μm.
Teljes méretű kép
A Gas2-indukálta autofágia downregulációja rizsszuszpenziós sejtekben
Teljes méretű kép
A Gas2 a rizs kaszpáz-3-szerű aktivitásának új szubsztrátja.
( nak nek ) Címkéjét fuzionáltuk az OsGAS2 N-terminálisába és a D110A/D113A mutánsba, és a fúziós fehérjét E. coliban expresszáltuk. A megtisztított vad típusú és az Ő 6-jelölt mutáns fehérjéit hőkezelt rizsszuszpenziós sejtek reakciópufferével, kaszpáz-3-mal és citozolos frakciójával inkubáltuk. Inkubálás után a reakciótermékeket 12,5% SDS-PAGE-val elemeztük, majd immunoblot-tást végeztünk anti-poli hisztidin antitesttel, amely felismerte a His 6-tagjelölt OsGAS2 N-terminális epitópot. A nyilak a célfehérje sávokat jelzik. ( ) Az OsGas2 kaszpáz-3 fragmentációjának sémája. A teljes hosszúságú, 74 KDa MW-os OSGas2-et lineáris molekulaként egy feltételezett DEPD 113 kaszpáz-3 hasítási hellyel szemléltetjük, amelyet nyíllal jelölünk. A kaszpáz-3 emésztés eredményeként egy N-terminális fragmens, amelynek MW-ja 14 KDa (N), és egy C-terminális fragmens, amelynek MW-ja 60 KDa ( C ).
Teljes méretű kép
A gas2 hasított terméke amplifikálta a kaszpáz-3-szerű aktivitást rizs protoplasztokban
A Gas2 hasítási termékek lehetséges funkciójának azonosításához a Gas2 N és C fragmenseket rizs mezofill protoplasztokban fejeztük ki Dex által indukált feltételes expressziós vektor alkalmazásával, és a Dex hatásosan indukálta fragmens expressziót (6a. Ábra). Az N fragmentum expressziójához és a vektorkontrollhoz képest a C fragmentum expressziója a kaszpáz-3-szerű aktivitás jelentős növekedését eredményezte hőkezelés után (6b. Ábra). Érdekes, hogy a két fragmenst expresszáló protoplasztokban DTT-kezelést követően nem találtunk autofagosómákat (az adatokat nem mutatjuk be).
( nak nek ) Az N-terminális fragmens (N) és a C-terminális fragmens (C) RT-PCR elemzése mezofil protoplasztokban. Teljes RNS-t készítettünk protoplasztokból Dex-kezeléssel vagy anélkül (kontroll) 18 órán át. 17S RNS-t használtunk terhelés kontrollként. ( ) Kaspáz-3-szerű aktivitás mezofil protoplasztokban az N-terminális fragmens (N) és a C-terminális fragmens (C) expressziója alatt. Az N és C expresszióját Dex indukálta 18 órán át, majd a protoplasztokat 48 ° C-on 15 percig kezeltük, és 6 órán át hagytuk helyreállni 28 ° C-on. Az üres feltételes expressziós vektort tartalmazó protoplasztot használtuk kontrollként. Egyforma mennyiségű citoszolos frakciót inkubáltunk Ac-DEVD-AMC-vel, és az AMC fluoreszcenciát 60 perc alatt mértük mikroprocesszorral 30 ° C-on. RFU/mg: relatív fluoreszcencia egységek 1 mg fehérje.
Teljes méretű kép
Vita
⊥: az ebben a dokumentumban bemutatott gátlás útja; folytonos nyíl: aktivációs, transzlokációs vagy lebomlási útvonal, amelyet ebben a dokumentumban bemutattunk; tábla nyíl: az az út, amelyet ebben a dokumentumban nem vizsgáltak; körkör: a feltételezett kaszpáz-3-szerű enzim. A részletekért lásd a szöveget.