A mir-302-367 expresszáló sejteket alkalmazó sejtalapú terápia elnyomja a növekedést
Tárgyak
Összegzés
Fő
A glioblastomák (GBM) az elsődleges agydaganatok leggyakoribb formái, amelyek bármilyen korú felnőtt betegeket érinthetnek. Ezek az erősen vaszkularizált és beszűrődő daganatok rezisztensek a jelenlegi terápiákkal szemben, és leggyakrabban kevesebb, mint 18 hónap alatt végzetes eredményhez vezetnek. A jelenlegi sugárterápiás kezelés és a temozolomid alkalmazása jobb eredményeket nyújt az MGMT gén metilált profiljával rendelkező betegek számára. 16, 17 E kezelés hatékonysága azonban még antiangiogén molekulák (bevacizumab) alkalmazásával is korlátozott, és ez a tumor továbbra is gyógyíthatatlan marad. A GBM agresszív viselkedését, beleértve a jelenlegi kezelésekkel szembeni rezisztenciát és a daganat kiújulásait, a GBM-szerű progenitor sejtek (GSC) jelenlétének tulajdonítják. 18,19 Ezért sürgősen ki kell dolgozni olyan új kezelési módszereket, amelyek kifejezetten a GBM-szerű őssejteket célozzák meg e gyógyíthatatlan daganatok felszámolására.
MikroRNS profilalkotó megközelítést alkalmazva a betegből származó, glioma-szerű sejtek (GSC) elsődleges tenyészeteinek gyűjteményében, kimutattuk, hogy a miR-302-367 klaszter visszafordíthatatlan differenciált állapotba hozza a CMS-t, és blokkolja daganatok iniciálásának és előrehaladásának képességét in vivo. 20 Jelen tanulmányban megmutatjuk, hogy a páciens eredetű GSC, amelyet arra terveztek, hogy stabilan és konstitutívan kifejezze a miR-302-367 klasztert, képes volt felszabadítani a miR-302-367 tartalmú exoszómákat. Ezeket az exoszómákat a szomszédos GSC gyorsan internalizálta, ami a proliferáció és a proliferációs tulajdonságok megváltozásához vezetett miR-302-367-függő módon. A miR-302-367-et és a GSC-t expresszáló sejtek ortotóp xenograftja hatékonyan megváltoztatta a daganat fejlődését az egerek agyában, bemutatva annak terápiás potenciálját a daganat kiújulásának blokkolásában. Vizsgálatunk szerint a sejtalapú terápia innovatív megoldás lehet a rák ellen.
Eredmények
A miR-302 csoportot expresszáló GSC parakrin módon elnyomja az SHH és SOX2 expresszióját, proliferációját és beszivárgását
Teljes méretű kép
A TG1-miR-302 és GB1-miR-302 sejtek olyan exoszómákat választanak ki, amelyek képesek elnyomni a GSC potenciáját és proliferációját
A daganatellenes hatásért felelős molekulák azonosításához ultraszűrést hajtottunk végre a kondicionált táptalaj nagysága alapján. Megjegyezzük, hogy a nagy molekulatömegű frakció (
Teljes méretű kép
Teljes méretű asztal
A miR-302 klaszter exoszóma szekréció útján kerül a szomszédos sejtekbe
Teljes méretű kép
Teljes méretű asztal
A miR-302 csoport expressziója a GSC-ben elősegíti a parakrin tumor szupresszor hatását in vivo
Ennek a megközelítésnek az eredményei, amelyeket egereken kaptunk, bizonyítják azt az elvet, hogy a rák kezelésére szolgáló sejtalapú terápia megfontolandó. A GSC-n kívül más exoszómát szekretáló sejteket, például makrofágokat is izolálhatunk a betegektől, és genetikailag módosíthatjuk, hogy stabilan expresszálják a terápiás RNS-molekulákat tumorok kezelésére.
Ezeknek a sejteknek a műtét során közvetlenül a tumor helyére történő transzplantációja lehetővé tenné a tumor szuppresszor exoszómák hosszabb ideig tartó helyi beadását, elkerülve az exoszómák súlyos és stresszes időszakos injekcióit a betegbe.
Összegzésképpen úgy gondoljuk, hogy tanulmányunk felkelti az érdeklődést egy sejtalapú terápia iránt a terápiás exoszómák in situ szállítására az emberi GBM megcélzásához.
Anyagok és metódusok
Elektron mikroszkóp
Dinamikus fényszórás (DLS)
A DLS mérést egy Zetasizer Nano-ZS-szel (Malvern Instruments, Malvern, Egyesült Királyság) végeztük. A mintákat 100 μl 1 × PBS-ben hígítottuk. 3 × 12 méréssorozatot végeztünk standard beállításokkal (törésmutató = 1,33, hőmérséklet = 25 ° C, viszkozitás = 0,88882 és dielektromos állandó = 79,0). Az eredményeket az OriginPro 2015 segítségével ábrázoltuk.
Mikrovezikulás extrakció.
10 6/ml GSC meghatározott mikrovezikulák nélküli táptalajban (NS34 + táptalaj, Fareh és mtsai.). 72 óra elteltével a GSC-ket centrifugálással eltávolítottuk (276xg, 4 ° C, 5 percig), és a kondicionált táptalajt összegyűjtöttük, 0,2 μm-es szűrőn (Millipore, Fontenay sous Bois, Franciaország) átszűrtük és bepároltuk. 100 kDa-os Amicon Ultra centrifugális szűrővel (Millipore,). A koncentrált kondicionált táptalajt használtuk a mikrovezikulák tisztítására ultracentrifugálással 200 000 x g sebességgel 110 percig.
Reagensek és antitestek.
Sejtkultúra-reagenseket, köztük DMEM, F12, glutamin, Hepes, nátrium-hidrogén-karbonát, N2, G5 és B27, pENTR klónozó készletet, LR Clonase II, Superscript II reverz transzkriptáz, DiIC16 (3), DiO16 (3) és TRIzol reagenseket vásároltunk a Life Technologies-től (Cergy Pontolse, Franciaország). A magzati borjúszérumot (FCS) a Hyclone-tól (Brebières, Franciaország), az Exoquick készletet pedig az Ozyme-tól (St. Quentin, Yvelines, Franciaország) vásárolta meg. A Hoechst 33342-t és az Actinomycin D-t a Sigma (St. Quentin Fallavier, Franciaország) szállította, a Micromount Mounting Media-t pedig a Leica Biosystems-től (Nanterre, Franciaország) szerezte be. A Taqman reverz transzkripciós mikroRNS készletet, az Universal Taqman PCR Master Mix és a Taqman szondákat az Applied Biosystems-től (Villebon sur Yvette, Franciaország) szereztük be. A továbbfejlesztett kemilumineszcencia detektáló reagenst a Bio-Rad-tól (Marnes la Coquette, Franciaország) szerezték be.