Az enzim-szubsztrát kapcsolat hatása a szarvasmarha-tejsavó Alcalasa® enzimatikus hidrolízisére

Az enzim-szubsztrát kapcsolat hatása a szarvasmarha-tejsavó enzimatikus hidrolízisére az Alcalasa® 2.4L segítségével

Omar A. Figueroa 1

Sandy P. Peñaloza 2

1 Mérnöki Kar, Agrotechnikai Tanszék, Universidad de la Guajira, Km 5 Vía Maicao, Riohacha, -Kolumbia. (e-mail: [email protected])

2 Mérnöki Kar, Agrotechnikai Tanszék, Univ. Popular del Cesar, Diagonal 21 No. 29-56 Valledupar-Colombia. (e-mail: [email protected]; [email protected])

3 Gyógyszerészeti és Élelmiszer-tudományi Kar, Élelmiszer-tanszék, Univ. De Antioquia, Calle 70 # 52-21, Apartado Aéro 1226, Medellín, Kolumbia. (e-mail: [email protected])

A vizsgálat célja az antioxidáns kapacitás (FRAP és ABTS módszerrel mért) és a vas kelátképző képességének elemzése volt az idő függvényében különböző enzim és szubsztrát körülmények között. A porított szarvasmarha-savó enzimatikus hidrolízisét szakaszos reaktorban hajtották végre, 0,5 l kapacitású és állandó hőmérsékletű reaktorban. A legnagyobb aktivitású hidrolizátumokat molekulaméretük szerint elválasztottuk> 100, 10-100, + alacsony arányban. A hidrolízis mértékének növekedése kedvez az ABTS módszerrel mért antioxidáns aktivitásnak, valamint a hidrolizátumok vas-kelátképző aktivitásának.

Kulcsszavak: enzimatikus hidrolízis; savó; alcaláz; fehérjék; antioxidáns peptidek

A tanulmány fő célja az antioxidáns kapacitás (FRAP és ABTS módszerrel mért) és a vas kelátképző képességének elemzése volt az idő függvényében különböző enzim- és szubsztrátkörülmények között. A szarvasmarha tejsavópor enzimatikus hidrolízisét szakaszos reaktorban, 0,5 l kapacitású és állandó hőmérsékletű reaktorban hajtottuk végre. A legaktívabb hidrolizátumokat molekulaméretük szerint választották szét> 100, 10-100, + kation alacsony alacsony szubsztrátok esetén. A hidrolízis fokának növekedése kedvez az ABTS módszerrel mért antioxidáns aktivitásnak és a hidrolizált fémek kelátképző aktivitásának.

Kulcsszavak: enzimatikus hidrolízis; tejsavófehérjék; alcaláz; fehérjék; antioxidáns peptidek

Különböző vizsgálatok igazolták a kapcsolatot a peptidek biológiai aktivitása és molekulatömege között. Különösen az 1–4 kDa közötti molekulatömegű peptidfrakciók lennének a legérdekesebbek táplálkozási és/vagy gyógyszerészeti felhasználásra (Saidi et al., 2014). Az ultra- és a nanoszűrés egyaránt olyan technológia, amelyet viszonylag sikeresen alkalmaznak a bioaktív hatású peptidek hidrolizált tejfehérjékből, szójababból és növényi szubsztrátokból történő megtisztítására (De Castro és Sato, 2015). Az enzimatikus fehérje-hidrolízis reakció bonyolult főleg a következők miatt: i) a szubsztrátok változatos és gyakran ismeretlen jellege (a különböző fehérjék primer és tercier szerkezete), ii) a reakció előrehaladtával új hidrolízis szubsztrátok képződése, iii) rövid peptidek és szabad aminosavak, amelyek komoly gátlást okoznak. iv) az enzim inaktiválása az idő múlásával (Valencia és mtsai, 2015), és v) a kötések eltérő reaktivitásával járó hatások az alkalmazott enzimhez képest, valamint hozzáférhetőségük a specifikus reakcióhelyekhez (harmadlagos szerkezet és kvaterner fehérjék) (Fernández és Riera, 2013).

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Ezután a reakciórendszerek kontrolljával, az alkalmazott analitikai módszerekkel és az alkalmazott kísérletek tervezésével kapcsolatos elemeket ismertetjük.

Reakciórendszer

A hidrolízist egy 0,5 liter űrtartalmú üvegreaktorban hajtottuk végre, a hőmérséklet szabályozására szolgáló vizes cirkulációs köpennyel, egy MX07R-20 termosztatikus szabályozóval ellátott keringőfürdőhöz (Thomas Scientific, USA ± 0,07 ° C) csatlakoztatva. A pH-érték szabályozásához és a reakció hőmérsékletének rögzítéséhez kombinált üveg elektródot használtunk, rögzített membránnal, egy számítógéppel (Tiamo 1.2.1 szoftver) működtetett Titrando 842 automata titrátorhoz (Metrohm, Svájc) csatlakoztatva. A reakcióközeget 801-es mágneses keverővel (Metrohm, Svájc) 400 fordulat/perc sebességgel folyamatosan keverjük. A rendszer hőmérsékletét és pH-ját állandóan tartottuk 61 ° C, illetve 9 értékkel.

Szarvasmarha tejből porított tejsavót használtak fel, amelyet Bogotá-Kolumbia városának kereskedelmi beszállítójától szereztek be, 12% -os bejelentett fehérjetartalommal. Ezeket az adatokat Kjeldahl-módszerrel (AOAC 2005, 954.01) támasztották alá, a fehérjetartalom becsléséhez konverziós tényezőként 6,38-at használtak. Az enzim megfelel az Alcalasa® 2,4 L (2,4 AU-A/g) élelmiszeripari minőségű (Novozymes, Dánia) kereskedelmi készítményből származó Bacillus licheniformis endoproteázának.

1. ábra. A kísérletben alkalmazott hidrolízis reakciórendszer vázlata.

Enzim hidrolízis folyamata

A reakciót pH-stat módszerrel szabályozott enzimatikus hidrolízissel hajtottuk végre, amelyet egyszerűsége miatt az enzimatikus hidrolízis során a legtöbbet elismertnek tekintenek (Rutherfurd, 2010), amely a pH állandó megtartásából áll bázis vagy híg sav hozzáadásával. Ebben az esetben, mivel lúgos reakcióról van szó, 1 M NaOH-t alkalmaztak. Elvileg a hozzáadott bázis a pH állandó tartása érdekében csak a fehérjék és peptidek lúgos pH-jú amidkötésének lebontása során felszabaduló protonokat semlegesíti. helyébe az alap kationja lép; így a hidrolízissel keletkező protonok ekvivalensek a hozzáadott bázis móljaival (Adler-Nissen, 1986). A GH becslést az (1) egyenlet felhasználásával készítettük.

Ahol: h = hidrolizált peptidkötések száma; Htot = a fehérjeszubsztrátban lévő peptidkötések száma (egyenérték/kg); VNaOH = az összes NaOH térfogata (L), Nb = a bázis normalitása, Mp = a fehérje tömege (kg-ban), GH = a hidrolízis mértéke.

A reakcióban felszabaduló α-NH2 csoportok disszociációjának mértékét, az α-t közvetlenül a (2) egyenletből számoljuk ki, és függ a működési pH-tól és a pK-tól. Ez utóbbi a reakció hőmérsékletétől függően jelentősen változik, és a (3) egyenlet alapján megbecsülhető (Salazar et al., 2012). Számított 0,992 α-értéket használtunk, és 8,8 meq/g htot-t jelentettek a tejsavófehérjék esetében (Adler-Nissen, 1986).

Ahol: α = a fehérje disszociációs foka és T = üzemi hőmérséklet Kelvin fokban.

Tervrajz

Az elemzés során az E0 (150, 300 és 600 mg/l) és az S0 (5,10, 10,20 és 20,40 g/l) hatását a reakcióidő alatt (0-120 perc) ellenőriztük az antioxidáns kapacitásra in vitro (ABTS és FRAP) és a vas kelátképző képesség (CQFe). A különböző függő változók evolúciójának összehasonlító elemzését két kísérleti csoportban végeztük: A) az S0 változása és az E0 állandó tartása; B) az S0 állandó és változó E0 tartása, az 1. táblázat szerint. A szubsztrátkoncentráció szintje egybeesik a Km-értékhez közeli régióval, ahol a kezdeti hidrolízis sebessége jelentős, a telítettségi görbében. Míg a felhasznált enzimszinteket korábbi publikálatlan tesztek határozták meg. Az elemzés során ismételt mérésekhez ANOVA-t alkalmaztunk egyénen belüli tényezővel (idő: 0, 10, 20,75 és 120 perc) és egy alanyok közötti faktorral (S0 vagy E0 minden kísérlethez), szignifikancia-statisztikával. 0,05. Minden hidrolízist a tervezés által meghatározott körülmények között három példányban hajtottunk végre.