Az exome-szekvenálás, majd a genotipizálás a sypl2-t sugalló génként sugallja

sypl2-t

  • Tárgyak
  • Összegzés
  • Bevezetés
  • Tantárgyak és módszerek
  • A minták kiválasztása
  • DNS előkészítés és csoportosítás
  • Exome szekvenálás
  • Olvassa el a leképezési szekvenálást, a variáns hívást és a funkcionális annotációt
  • Változatos szűrés és dúsítás az elhízás szempontjából.
  • A variánsok validálása genotipizálással
  • Az asszociáció statisztikai elemzése.
  • Eredmények
  • Ritka variánsok felfedezése exome szekvenálással
  • SNV validálás és asszociációs elemzés
  • Vita
  • Kiegészítő információk
  • Word dokumentumok
  • Kiegészítő információk

Tárgyak

Összegzés

Bevezetés

A közelmúltban kifejlesztett nagy áteresztőképességű szekvenálási technológia kiegészíti az SNP tömböket, és megmutatja a ritka betegségeket okozó variánsok kimutatásának képességét az összes ismert exon mély szekvenálásával. 7, 8, 9 Ez a technológiai forradalom az összetett betegségek tisztázását ígéri azáltal, hogy lehetővé teszi alacsony frekvenciájú egész genom keresést, valamint ritka és állítólag funkcionális variánsokat. Az exome-szekvenálás hatékonyabb lehet, ha olyan betegekre alkalmazzák őket, akiknél a gyakori betegségek szélsőségesebb formái, például kóros elhízás; egyrészt megnöveli annak esélyét, hogy jelentős társulást érjünk el a nagy penetranciájú ritka változatok esetében; másodszor, a fehérjét kódoló szekvencia genetikai variánsai valószínűleg nagyobb hatással lesznek a fenotípusra, mint az intergenikus régiók variánsai.

Ebben a tanulmányban exome szekvenálást alkalmaztunk dúsított alacsony frekvenciájú és ritka génvariánsok kimutatására kórosan elhízott felnőtteknél, és validáltuk azokat soha nem elhízott idősebb felnőttekkel szemben. Úgy véltük, hogy így gazdagítanánk az elhízás génjeit az esetek között, és ezeket a géneket szűrnénk a kontrollokban. Itt egy alacsony frekvenciájú, elhízáshoz kapcsolódó variánsról számolunk be a 2. típusú szinaptofizin gén kódoló régiójában (SYPL2).

Tantárgyak és módszerek

A minták kiválasztása

Teljes méretű asztal

Az exom-szekvenálás nem elhízott kontrolljainak skoliozisa volt. Egyébként az összes többi kontroll alany egészséges volt az önjelentés szerint. A nők túlreprezentáltak voltak a vizsgált kohorszokban. Az elhízott nők nagyobb valószínűséggel fordulnak orvoshoz elhízásuk miatt. A gerincferdülés a nők körében gyakoribb. Az alanyok európai származásúak voltak és Svédországban éltek. A tanulmányt a helyi etikai bizottságok jóváhagyták, és minden alany megalapozott beleegyezését adta a részvételhez.

DNS előkészítés és csoportosítás

Genom DNS-t állítottunk elő PBMC-ből a QiAmp DNS Blood Maxi Kit (Cat. No. 51194, Qiagen, Hilden, Németország) felhasználásával. A DNS tisztaságát és minőségét az A260/280> 1,8 arány Nanodrop (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) és agaróz gél elektroforézissel igazolta. A DNS-koncentrációt a Qubit (Life Technologies, Stockholm, Svédország) mérte. Ezt követően minden DNS-mintából 0,8 μg-ot vettünk, és véletlenszerűen 10 csoportra osztottuk őket, amelyek mindegyike 10 elhízott esetekből vagy kontrollból származó mintát tartalmazott. Az egyesített DNS-minták koncentrációit Qubit-tal mértük, és a mintákat agarózgélen futtattuk.

Exome szekvenálás

Az exome szekvenálást a Science for Life Laboratóriumban (SciLifeLab), Stockholm, Svédország végezték. Minden DNS-könyvtárat 3 ug összesített genomi DNS-ből készítettünk. A DNS-t Covaris S2 műszerrel 300 bp-on vágtuk, és a SureSelectXT Human All Exon 50 Mb készlettel és egy Agilent NGS munkaállomással gazdagítottuk a gyártó utasításainak megfelelően (SureSelectXT Automated Target Enrichment for Illumina Paired-End Multiplexed Sequencing, A verzió, Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornia, USA).

Az összevonást egy cBot klaszterépítő rendszeren végeztük HiSeq párosított végű leolvasó fürtépítő készlet felhasználásával a gyártó utasításai szerint (Illumina, San Diego, Kalifornia, USA). A mintákat egy Illumina HiSeq 2000-n szekvenáltuk, páros olvasás mellett 100 bp/olvasás mellett (Illumina). Az összes sávot 1% -os phiX kontroll könyvtárral dúsítottuk, a 8. sáv kivételével, amely 2% phiX volt. A szekvenálási futtatásokat a gyártó utasításai szerint hajtották végre. Az alapkonvertálás az Illumina OLB v1.9 (Illumina) segítségével történt.

Olvassa el a leképezési szekvenálást, a variáns hívást és a funkcionális annotációt

A szekvenálás leolvasásait a Burrows-Wheeler Aligner (BWA 0.6.1 verzió, a//bio-bwa.sourceforge.net/, Li és Durbin 12) olvasott vágási paraméterrel - q 20-ból. A szekvenciaváltozókat a samtools-0.1.18 (//samtools.sourceforge. net /), minimális térképezési minőséggel 20 és minimális leolvasási mélységgel 5x a szűréshez. A PCR-duplikátumokat az úgynevezett variáns előtt mintatartó szerszámokkal távolítottuk el. A szekvenciaváltozatok funkcionális annotációjához annovar-t (//www.openbioinformatics.org/annovar/, Wang és mtsai 13) használtunk a különféle adatbázisokból származó információk nyilvános tartományokba történő integrálásához, például a génreferenciához (/ /hgdownload.soe ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/refGene.txt, 2013), dbSNP-k (SNP135, //hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/snp137.txt.gz) és az 1000 Genome projekt (//www.1000genomes.org/).

Változatos szűrés és dúsítás az elhízás szempontjából.