Fehérjetisztítási technikák; News-Medical
Figyelem: Ez az oldal az oldal eredeti fordítása angolul. Ne feledje, hogy mivel a fordításokat géppel generálják, ne azt, hogy minden fordítás tökéletes lesz. Ezt a weboldalt és oldalait angol nyelven kívánják olvasni. Ennek a weboldalnak és weboldalainak bármilyen fordítása részben vagy egészben pontatlan és pontatlan lehet. Ez a fordítás kényelmi szolgáltatásként szolgál.
A fehérjetechnikai technikák elengedhetetlen részei a különféle ipari folyamatokban alkalmazható specifikus tulajdonságú fehérjék testreszabásának vagy előállításának. Így kulcsfontosságúak a biotechnológiai kutatás szempontjából.
Ezek a módszerek azonban nagymértékben támaszkodnak arra, hogy képesek elkülöníteni és megtisztítani a kívánt fehérjéket annak érdekében, hogy megértsék azok fizikai és kémiai tulajdonságait, valamint a tercier struktúrájukat és a ligandumokkal és szubsztrátokkal való kölcsönhatásukat.
A tisztítási folyamat intenzitása a fehérje felhasználásától függ. Például a gyógyszerészeti és élelmiszer-fehérjéket nagy tisztaságú lejtőre kell hozni, és több, egymástól egyedülállóan lehetséges, egymást követő lépésen kell keresztülmenniük, mivel minden lépésben elkerülhetetlenül elveszik egy-egy fehérje.
A fehérjemolekulák tisztítása egyszerűbb, mint a fehérjekomplexek tisztítása.
1. lépés: Készítsen kivonatot a nyersfehérjéből
Az intracelluláris fehérjék nyers kivonatait úgy állítják elő, hogy a sejtet kémiai vagy mechanikus eljárásokkal lizálják. Ezután a törmeléket centrifugálással eltávolítják. A kapott felülúszó távol áll a tiszta formától, sok más makro- és mikromolekulával keveredik.
Az extracelluláris fehérjéket az oldat centrifugálásával és a sejtek eltávolításával nyerjük. A termostabil enzimek nyers kivonatának megszerzésére szolgáló specifikus módszer az, hogy a keveréket más fehérjék denaturálására melegítjük, majd lehűtjük az érdeklődésre számot tartó hőstabil fehérjék megreformálására, végül centrifugáljuk a denaturált fehérjék eltávolítására.
2. lépés: köztes tisztítás
Sózás
A nyers extraktumban lévő fehérjéket ezután megtisztítjuk erősen koncentrált sóoldatban, például ammónium-szulfátban kicsapva. Ez a fehérje alacsony sótartalma alapján működik nagy sókoncentrációk esetén. Az összes fehérje azonban nem csapódik le azonos sókoncentrációban, ami azt jelenti, hogy a sózás a fehérjék lebontásában is segít. Alkalmazható fehérjék oldatban történő koncentrálására is. Ez a lépés háromszor növeli a tisztaságot, és az oldatban lévő fehérje 92% -át kinyerik.
Dialízis
A fehérjék nagy molekulák, és ez azt jelenti, hogy a fehérjék sói megőrződnek, ha az oldatot féligáteresztő membránon vezetik át. A cellulóz tipikus dialízismembrán. A dialízist nem lehet különféle molekulatömegű fehérjék szétválasztására használni.
Kromatográfia
A sós fehérjék eltávolítására használt egyéb technikák közé tartozik a kromatográfia és a gélkizárásos szűrés. Ezek ma már előkészített készletekként kaphatók számos standard fehérjéhez, és gyakran alkalmasak nagy léptékű folyamatokra.
A gélszűrés a méret elválasztása alapján működik a polimer porózus öntvényeinek oszlopán, például dextránon vagy agarózon keresztül. A nagy molekulák csak a trimm közötti réseken tudnak áramolni, míg a kisebb molekulák ezeket a réseket és a trimmen belüli helyet elfoglalják, csökkentve azokat. Így az eluens a kialakuló molekulákat méretük sorrendjében tartalmazza, a legnagyobbtól a legkisebbig. Fordított fázisú vagy ioncserélő kromatográfiás technikákat is alkalmaznak, amelyek differenciált hidrofób tulajdonságok, illetve töltés alapján működnek. A reverz kromatográfia korlátozható a fehérje szerves oldószerekkel történő lehetséges denaturációja miatt.